[发明专利]以脂肪醇形成酰基CoA还原酶(FAR)产生脂肪醇

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年6月30日提交的临时申请第61/221,934号和于2010年3月18日提交的临时申请第61/315,380号的权益，其全部内容通过引用并入本文。

对序列表的引用

根据37C.F.R.§1.821、经由文件名CX3-017US-ST25.txt以计算机可读形式(CRF)以电子方式同时提交的“序列表”通过引用并入本文。2010年6月28日创建了序列表的电子副本，且磁盘上的大小为82Kb。

背景

柴油燃料是用于柴油机的任何燃料，并包括石油柴油和生物柴油二者。石油柴油是化石燃料油的特定分馏物。其包括约75％的饱和烃类和25％的芳香烃类。生物柴油不是来源于石油而是来源于植物油或动物脂肪并包含长链烷基酯类。生物柴油通过脂质(例如，来自油炸锅的用过的植物油或种子油)与醇的酯交换而生成，且比石油柴油燃烧更清洁。生物柴油可单独使用或以任何量与石油柴油混合使用以用于现代发动机。

煤油是可燃的烃，其也是化石燃料的特定分馏物，且包含具有6至16个碳原子的烃类。煤油具有与石油柴油相当的燃烧热，且广泛用于喷气燃料中以为喷气发动机提供动力和在某些国家用于供暖。基于煤油的燃料也可利用液态氧来燃烧并用作火箭燃料(例如，RP-1)。

对石油衍生的燃料的依赖已使自然资源的供给枯竭且需要更多依赖于进口的汽油和柴油产品。此外，石油基燃料的燃烧增加了大气中温室气体(例如，二氧化碳和甲烷)的量，这助长了地球气候的逐渐变暖。

燃料，比如生物柴油，由动物产物或植物产物制成，比石油衍生的燃料燃烧更清洁，且不产生温室气体的净增量。并且，它们是可持续能源并可能减少美国对进口石油基产品的依赖。然而，存在着使用土地来生产燃料作物而非粮食作物将促使世界饥饿的担心。

脂肪酸是细胞膜的主要成分，且几乎所有生物体将其用作能量贮存的主要来源。脂肪醇是脂肪酸的还原产物，并且和脂肪酸一样可由培养的细胞酶促产生。可将脂肪醇与酸反应以形成与生物柴油燃料中存在的酯组合物相似的酯组合物，或可将脂肪醇还原以形成类煤油(kerosene-like)组合物，或与石油柴油相似的烃组合物。将脂肪酰硫酯底物(例如，脂肪酰CoA或脂肪酰ACP)转化为脂肪醇的酶常称作脂肪醇形成酰基CoA还原酶或脂肪酰还原酶(“FAR”)。

PCT公布WO 2007/136762公开了用于产生脂肪酸衍生物的遗传工程化的微生物和它们的使用方法。

PCT公布WO 2009/140695公开了包括编码参与烃生物合成的酶的蓝细菌基因的组合物和将它们用于产生醛类和醇类的方法。

Steen等人.，2010，Nature 463：559-563公开了大肠杆菌(E.coli)的工程化以直接从单糖产生特定的脂肪醇酯(fatty ester)、脂肪醇和蜡类。

Schirmer，2009，Current Opinion in Microbiology 12：274-281描述了用于产生类燃料分子的异养微生物的发酵代谢和非发酵代谢，将代谢中间体转化为类燃料分子的生物催化剂，和决定所述类燃料分子的具成本效益的产生的参数。

美国专利第5,370,996号和Metz等人(2000)Plant Physiology122：635-644公开了来自较常称作荷荷巴(jojoba)的荒漠灌丛希蒙得木(Simmondsia chinensis)的脂肪酰还原酶(FAR)酶的分离和表征。

Moto等人(2003)Proc.Nat’l Acad.Sci USA 100(16)：9156-9161公开了来自蚕蛾家蚕(Bombyx mori)的FAR酶的分离和表征。

Reiser等人(1997)J.Bacteriol.179(9)：2969-2975公开了来自产蜡酯细菌乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的脂肪酰CoA还原酶的分离和表征，该酶将具有从C14到C22的链长度的脂肪酰CoA底物还原为相应的脂肪醛，需要脱氢酶以将脂肪醛转化为脂肪醇。

理论上，这些FAR酶可在异源宿主中表达，作为产生用于生物燃料的非石油基的、可再生来源的脂肪醇或衍生组合物的手段。然而，当在诸如大肠杆菌和酵母的异源宿主中表达时，所获得的脂肪醇的产量不足以用于某些应用。此外，产生的脂肪醇至多仅小部分被微生物分泌，这大大增加了纯化的成本。