[发明专利]使用非内源pol I启动子的反向遗传

说明书

本专利申请要求2009年5月21日提交的美国临时专利申请61/216,919号的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。 

技术领域

本发明涉及反向遗传领域。此外，其涉及制造用于保护抵御各种病毒的疫苗。 

背景技术

反向遗传可在细胞培养中重组表达和操作RNA病毒。它是病毒学和疫苗制造的有效工具，因为能快速生产重组病毒(包括重排列)和/或其突变型。所述方法涉及用一种或多种编码所述病毒基因组的表达构建体转染宿主细胞和从所述细胞中分离所述病毒。例如，参考文献1和2描述了在犬细胞中用犬pol I启动子表达流感基因组RNA的方法。其他来源报道了在人细胞中用人pol I启动子表达流感基因组RNA。 

本方法现有技术的一个显著缺点是pol I启动子高度物种特异。例如，已报道人pol I启动子仅在灵长目细胞中起作用[3]，而相似地，在犬细胞中表达需要犬pol I启动子。因此，需要在所述内源pol I启动子未被识别的细胞系中生长病毒时，必须使用两种不同的细胞型以拯救和培养所述病毒。然而，需要避免使用多重细胞系，因为这样具有例如避免竞争培养物选择压力的优势。疫苗生产中所有步骤使用单一细胞系还有助于监管的批准。因此本领域一直需要提供实施反向遗传的替代方法。 

优选实施方式概述 

现在本发明人意外发现可在宿主细胞中用pol I启动子驱动转基因表达，所述启动子对与所述宿主细胞相同分类学目的生物中是非内源的。 

在一种实施方式中，本发明提供含一种或多种表达构建体的宿主细胞，其中所述构建体的RNA分子表达受所述宿主细胞目的非内源pol I启动子控制。这些宿主细胞可用于本发明的表达系统。 

本发明还提供宿主细胞中RNA表达的方法，包括步骤(i)制备由第一 生物的pol I启动子驱动表达感兴趣转基因的表达构建体和(ii)将步骤(i)的表达构建体导入宿主细胞，其中所述宿主细胞与所述第一生物的分类学目不同。 

在进一步的实施方式中，本发明提供生产重组病毒的方法，其中用本发明的宿主细胞生产所述病毒。 

本发明还提供制备病毒(如，用于配制成疫苗)的方法，包括步骤(i)用本发明的宿主细胞生产重组病毒，(ii)用步骤(i)获得的所述病毒感染培养宿主，(iii)培养步骤(ii)的培养宿主以生产病毒；和(iv)纯化步骤(iii)获得的所述病毒。为提供制备疫苗的方法，本方法随后可进一步包括步骤(v)将所述病毒配制成疫苗。 

除了如上所述导入的非内源pol I启动子，所述宿主细胞将包括内源polI启动子。所述非内源pol I启动子在细胞内驱动非内源RNA的表达，尤其是所述病毒RNA。因此本发明提供具有至少一种控制内源rRNA表达的内源pol I启动子和至少一种控制病毒RNA或其互补物表达的非内源pol I启动子的细胞。 

本发明还提供编码蛋白编码mRNA和病毒RNA的DNA表达构建体，其中(i)所述DNA中用于蛋白编码mRNA的密码子针对犬细胞优化且(ii)所述病毒RNA受到灵长目pol I启动子的控制。所述犬细胞理想地为MDCK细胞且所述灵长目启动子理想地为人pol I启动子。所述蛋白编码mRNA的表达可在针对犬细胞优化的pol I启动子的控制下。 

表达构建体 

本发明人意外发现可在细胞中用来自与所述细胞不同分类学目的生物的pol I启动子驱动RNA表达。因此所述pol I启动子对于来自衍生所述细胞的同一分类学目的生物中是非内源的。术语“目”指常规分类学分级，目的示例为灵长目、啮齿目、食肉目、有袋目、鲸目等。人和大猩猩在同一分类学目中(灵长目)，但人和狗在不同的目中(灵长目与食肉目)。 

因此在第一方面，本发明提供含一种或多种表达构建体的宿主细胞，其中所述构建体的RNA分子表达由所述宿主细胞目的非内源pol I启动子驱动。