[发明专利]核酸检测

说明书

技术领域

本发明涉及核酸的检测和鉴别，特别涉及多元核酸检测系统。

发明背景

核酸(例如病毒的)的多元检测被特别描述于专利说明书WO/2004/085455中，其描述了将样品置于多个孔中，然后平行地使每个样品都经受检测过程。

已显示，有可能通过免疫学技术来对引起疾病的试剂进行多元检测，一个实例是LUMINEX系统，其被描述于专利说明书WO/2002/024959中。另一种技术是将靶分子杂交到阵列上，如专利说明书WO/2008/054830中所描述的。此类方法的劣势是用于生成结果所花费的时间。此外，它们需要大量样品以确保能够成功地检测通常非常稀释的分析物。备选的方法是PCR方法，其被描述于美国专利说明书No.4,683,202中。传统地，核酸是在PCR之后通过大小分级而被检测的，这是一个费时的过程，但是当使所产生的扩增物经受某些下游过程(例如电泳)时，有可能通过其大小而检测多重分析物。近来，大多数核酸检测系统依赖于实时PCR，例如美国专利说明书No.6,814,934中所描述的。实时PCR的明显劣势是对于用于进行测试的设备的物理限制-它们受限于检测最多5种靶分子。这一限制是物理的，是由于其光学系统的设计并且光学设计还导致光学通道之间的串扰。由于来自所需分析物的光被来自存在于反应容器中的其它产物的光投上阴影，这实际上使得很难对所存在的分析物的水平进行定量。

因此，目标仍旧是能够在尽可能短的时间内检测单一样品中的所有病原体。当诱发剂可以是病毒和/或细菌组中的任意一种时，未鉴别的感染的爆发很好地呈现了要满足这种需求的情形。在广泛的领域中也有此目标，例如人类遗传学和用于案发现场分析的DNA指纹分析。另一个重要的目标是准确检测和鉴别短的核酸序列，其在亚75bp、但优选亚60bp扩增子大小的范围内。这些用传统的方法(包括上述那些)不能被可靠地分析。

置于目前可获得的化学作用之上的限制是由测试方法本身的特征所施加的。检测的遗传学方法包括使用嵌合染料(例如SYBR)，其允许检测但是在应用领域具有如下的主要劣势：它们不是核酸序列特异性的。这引起发明了许多要求分子相互作用的检测系统或探针，其要求存在正确的核酸序列以产生信号。这些的一个实例被描述于专利说明书WO97/46707中。此方法的劣势是，额外的分子在此类技术上设置了设计负担，因为有可能被检测到的最小大小的扩增子。此外，由探针提供的分子检测是更高阶的事件，因为必须允许有时间以使信号生成。

自探测引物是本领域已知的，然而，那些(例如LUX系统)不是序列特异性的，并且所产生的任何伪产物都将类似地生成信号。其它已知的化学作用，即Scorpions GB 2338301和‘Angler’方法(Lee，M.A.et al.(2002)，Analytica Clinica Acta 457：61：70；Whitcombe，D.et al.(1999)，Nature Biotechnology 17：804-807)，利用的是它们自身在经扩增的序列内探测的引发序列。这些因而要求发生更高阶的事件，即与所希望的靶杂交并且不迎合短的扩增物，因为必须有足够的空间以允许待探测的序列被包含在扩增物内。

本发明提出了许多克服这些限制的手段，特别是关于检测大小在60个碱基以下的短核酸片段，60个碱基的大小是现存的化学反应所要求的。嵌合染料方法虽然扩增效率高，但将倾向于似乎对于短的产物具有低的特异性，因为高的背景掩盖了短的扩增子所产生的相对低的信号。此外，此类短的扩增子就是不具有足够的可得碱基用于采用传统的探针方法，且60个碱基左右似乎是分界点。

此类短的扩增子在其中靶DNA可能被剪断的测试中是有利的，例如当试图检测经宿主免疫系统处理的病原体核酸时就是这种情形。备选地，小的干扰RNA(siRNA)研究的焦点在于大小在20至超过30个碱基范围中的双链RNA分子，而使用现有的探针技术不可能检测这些分子。可能的情况是，区分致病型的DNA序列可由核苷酸的短的重复组成，而能够准确地确定仅仅是重复的数目却不受来自相同的基因组区域的干扰可以是有利的。此种方法对于所有测定类型的其它益处是此类短扩增子所固有的增加的反应速度和PCR效率。

在本专利说明书中，用语容器是指能够盛载待处理的物质或样品的任何设备，并且因此可包括下列或由下列组成：孔、管(开放或闭合的)、玻片(可能是以硅片的形式)或盘。本发明特别涉及孔形式的微量滴定容器。