[发明专利]经遗传修饰的微生物的生成方法

说明书

本申请要求2009年6月1日提交的美国临时专利申请61/183,031的优先权，该申请在此全文参考并入。

1.技术领域

本申请提供的方法和组合物总体上涉及微生物的工业应用，例如酵母。本申请提供了一种经遗传修饰的微生物，所述修饰能显著降低微生物在自然界散播的风险，尤其是其重组的DNA序列在自然界的散播。还提供了生产和利用所述经遗传修饰的微生物的方法。

2.背景技术

重组DNA技术的发展使得可以利用原核生物和真核生物来大量生产工业上有用的产品。在真核生物中，酵母(特别是，属于酵母菌属(Saccharomyces)的酵母)被广泛用于生产发酵产品。一般而言，酵母能够快速生长，并可以在比细菌更高的密度下培养，而且不需要在工业条件下的无菌环境。此外，酵母比细菌更易于从培养基中分离，大大简化了产物的分离和纯化过程。由于这些特性，酵母(特别是带有重组DNA序列的经遗传修饰的酵母)被用作表达有用产物的宿主，并且此类酵母的应用也已经建立。但是，在工业中应用经遗传修饰的酵母存在潜在的环境风险，因为这些酵母和/或它们含有的重组DNA序列的散播可能对生态系统带来不可预知的影响。因此，需要有一种酵母，其适用于工业应用，但是其在自然界中散播和繁殖的风险降低，特别是其重组DNA序列在自然界中的散播的风险降低。

3.发明概述

本申请提供了一种具有孢子形成障碍和内源性交配障碍的经遗传修饰的微生物的生成方法，例如经遗传修饰的酵母菌株的生成方法。本申请提供的方法包括，在经遗传修饰的单倍体微生物细胞，如酵母细胞中，功能性破坏一个或多个孢子形成基因和/或一个或多个信息素应答基因，以及诱导所述经遗传修饰的单倍体微生物细胞形成稳定的二倍体，由于缺乏孢子形成能力和/或交配能力，该二倍体不能有效地进行有性繁殖并且其生命周期被限制在二倍体状态。按照本申请提供的方法进行遗传修饰的微生物，如酵母菌株，具有工业用途，如用于工业发酵，并且可提供的优势有，在自然界中通过与野生型微生物交配而导致散播和繁殖的风险显著降低。

一方面，本申请提供的经遗传修饰的酵母细胞包含：在一个或多个孢子形成基因中的功能性破坏，其中由于所述一个或多个孢子形成基因的所述破坏，使得所述酵母细胞缺乏孢子形成能力；在一个或多个信息素应答基因中的功能性破坏，其中由于所述一个或多个信息素应答基因的所述破坏，使得所述酵母细胞缺乏内源性的交配能力；以及一个或多个整合的异源目标核苷酸序列。在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞是异宗配合的(ho)。在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞是二倍体细胞，其中一个或多个孢子形成基因的两个拷贝和/或一个或多个信息素应答基因的两个拷贝都被功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的二倍体细胞除其交配型等位基因以外是纯合的。在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞是单倍体细胞。在一些实施方式中，经遗传修饰的单倍体细胞进一步含有编码同宗配合(HO)蛋白质的重组质粒。在一些实施方式中，经遗传修饰的单倍体细胞包含一个或者多个重组质粒，其编码一个或多个信息素应答基因，所述信息激素应答基因在所述酵母细胞中被功能性破坏。

在一些实施方式中，可用于实践本申请提供的方法的经遗传修饰的酵母细胞是酿酒酵母细胞。在一些实施方式中，酿酒酵母细胞是Baker’s酵母、Mauri、Santa Fe、CBS 7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS 7963、CBS 7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1或AL-1菌株。在一些具体的实施方式中，酿酒酵母细胞是PE-2菌株。另外一些具体的实施方式中，酿酒酵母细胞是CAT-1菌株。

在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞中，被破坏的一个或多个孢子形成基因选自下组：IME1、IME2、NDT80、SPO11、SPO20、AMA1、HOP2和SPO21。在一些具体的实施方式中，IME1基因被破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞中，被破坏的一个或多个信息素应答基因选下组：STE5、STE4、STE18、STE12、STE7和STE11。在一些具体的实施方式中，STE5基因被破坏。在一些具体的实施方式中，经遗传修饰的酵母细胞包含STE5基因和IME1基因两者的功能性破坏。在一些实施方式中，经遗传修饰的酵母的单倍体细胞包含基因STE5的功能性破坏和编码STE5蛋白的重组质粒。