[发明专利]轭合方法

说明书

本申请要求2009年6月3日提交的美国临时申请号61/183,774的优先权，其完整公开内容在此明确通过引用并入。

发明领域

本发明涉及使效应基团(例如，细胞毒性剂)或报道基团(例如，放射性标记)与细胞结合剂例如抗体或其片段通过双官能连接体轭合的新方法。更具体地，本发明涉及使效应基团(例如，美登木素生物碱)或报道基团(例如，放射性标记)与细胞结合剂(例如抗体或其片段)通过双官能连接体轭合的新方法，使得该过程消除了导致由于分子内或分子间反应而生成的不期望的水解物类或不期望的交联物类生成的步骤。

发明背景

细胞结合剂例如抗体与效应基团例如小细胞毒性剂或细胞毒性蛋白的轭合物在开发抗癌治疗剂方面引起浓厚兴趣(Richart，A.D.和Tolcher，A.W.，2007，Nature Clinical Practice，4，245-25)。这些轭合物由于针对肿瘤细胞的细胞表面上表达的抗原所选择的抗体的高特异性而是肿瘤特异性的。当特异性结合至肿瘤细胞时，抗体-细胞毒性剂轭合物被内化入靶癌细胞并在其中降解，由此释放抑制必要细胞功能例如微管动力学或DNA复制的活性细胞毒性剂，导致癌细胞的杀伤。已经采用各种连接体连接抗体与细胞毒性剂，目的是增强内化时细胞内物质的递送和轭合物的加工，同时保持轭合物在血浆中期望的稳定性。这些连接体包括被设计具有不同程度的空间位阻而影响其分子内硫醇还原动力学的二硫化物连接体、可裂解的肽连接体例如缬氨酸-瓜氨酸连接、和不可裂解连接体例如硫醚连接(Widdison，W.等，J.Med.Chem.，2006，49，4392-4408；Erickson，H.等，Cancer Res.，2006，66，4426-4433)。

细胞结合剂例如抗体与标记或报道基因的轭合物用于癌症患者的肿瘤成像应用、诊断各种疾病的免疫测定应用、使用放射性核素-配体轭合物的癌症疗法、和纯化生物活性剂例如蛋白、肽和寡核苷酸的亲和色谱应用。与细胞结合剂轭合的标记或报道基因包括荧光团和亲和标记例如生物素。

经由不可还原的连接(例如硫醚连接)连接的细胞结合剂例如抗体(Ab)与效应基团(例如，细胞毒性剂)或报道基团(例如，放射性标记)的常规轭合方法采用两个不同的抗体反应步骤，并必须使用纯化步骤。在第一反应步骤中，抗体与带有两个不同反应性基团(例如，X和Y)的异双官能连接体反应。例如，在一种方法中，抗体的反应性残基(例如赖氨酸氨基残基)与异二双官能试剂的X反应性基团(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)的反应导致在抗体的一个或多个反应性残基(例如赖氨酸氨基残基)处加入具有Y反应性基团的连接体。最初修饰的抗体产物必须在可以发生下一步骤之前从过量连接体或水解连接体试剂纯化。在第二反应步骤中，含有Y反应性基团(例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)的连接体修饰的抗体与含有反应性基团例如硫醇的效应物例如效应基团(C)(例如，细胞毒性剂)反应生成抗体-效应物轭合物，其在额外纯化步骤中再次纯化(参见例如，美国专利5,208,020、5,416,064或5,024,834)。因此，在以上方法中，需要至少两个纯化步骤。

包括两个反应和纯化步骤以轭合抗体与效应基团或报道基团的另一种方法利用抗体中的硫醇残基(通过用硫醇生成试剂例如2-亚胺基硫烷修饰抗体或者通过诱变加入非天然半胱氨酸残基或者通过还原天然二硫键而产生)与含有Y反应性基团(例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺)的同双官能连接体Y-L-Y反应。

在抗体或肽中加入反应性基团Y例如马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)的主要缺点是反应性马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)基团与抗体或肽中天然组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱氨酸残基经历分子内或分子间反应(Papini，A.等，Int.J.Pept.Protein Res.，1992，39，348-355；Ueda，T.等，Biochemistry，1985，24，6316-6322)，以及Y马来酰亚胺基团的水性失活。在与效应基团或报道基团C的第二反应之前，抗体中加入的马来酰亚胺(或卤代乙酰胺)基团Y与抗体中天然组氨酸、赖氨酸或半胱氨酸残基的不期望的分子内或分子间反应以及Y马来酰亚胺基团的水性失活产生交联蛋白或不均一轭合物并降低与效应基团或报道基团C的第二反应的效率。不均一轭合物产物—由于最初加入的基团Y(例如马来酰亚胺基团)与抗体或肽中天然基团(例如组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱氨酸)的不期望反应或水性失活产生的无活性马来酰亚胺残基而产生的交联蛋白或肽—可能具有比期望的均一轭合产物差的活性和稳定性。