[发明专利]化学连接依赖性的探针扩增(CLPA)

说明书

相关申请

本申请要求2009年4月1日提交的美国临时申请号61/165,839的优先权，其整个公开内容通过引用并入本文，如同在本文中予以完整阐述。

技术领域

本发明涉及使用化学连接检测样品中的核酸的组合物和方法。

背景技术

本发明涉及用于检测样品中存在的一种或多种核酸靶物的组合物、仪器和方法。特定核酸的检测是诊断医学和分子生物学研究的一种重要工具。

基因探针测定法目前在下述方面起作用：鉴别传染性生物体诸如细菌和病毒、探测正常基因和突变基因的表达以及鉴别与疾病或损伤有关的基因(诸如癌基因)、在组织移植之前分型组织的相容性、匹配用于法医学的组织或血液样品、对紧急响应情形(如核事故或流行性流感暴发)做出响应、测定疾病预后或病因、和探查来自不同物种的基因之间的同源性。

理想地，基因探针测定法应当是灵敏的、特异性的和可容易地自动化的(关于综述，参见Nickerson，Current Opinion in Biotechnology(1993)4：48-51)。通过开发聚合酶链式反应(PCR)和允许研究人员在分析之前指数地扩增特定核酸序列的其它扩增技术，已经极大地减轻了对灵敏度(即低检测限)的要求(关于综述，参见Abramson等人，Current Opinion in Biotechnology，(1993)4：41-47)。例如，已经证实，对SNP基因座进行多重PCR扩增并随后与寡核苷酸阵列杂交，是同时对数百个SNP进行基因分型的准确的且可靠的方法(参见Wang等人，Science，(1998)280：1077；也参见Schafer等人，Nature Biotechnology，(1989)16：33-39)。

特异性也是许多目前可利用的基因探针测定法的一个问题。探针和靶物之间的分子互补性程度决定了相互作用的特异性。杂交反应中探针、靶物和盐的组成和浓度的变化以及反应温度和探针长度都可以改变探针/靶物相互作用的特异性。

在有些情况下，区分具有精确互补性的靶物和具有错配的靶物是可能的，尽管在使用传统技术的情况下这通常是非常困难的，因为反应条件的小变动会改变杂交。对于错配检测具有必要的特异性的更新的技术包括探针消化测定法(其中错配会建立探针切割位点)和DNA连接测定法(其中单点错配会阻止连接)。

多种酶的和非酶的方法可用于检测序列变动。基于酶的方法的实例包括Invader^TM、寡核苷酸连接测定法(OLA)、单碱基延伸方法、等位基因PCR、和竞争探针分析(例如通过杂交进行竞争测序)。酶法DNA连接反应是本领域众所周知的(Landegren，Bioessays(1993)15(11)：761-5；Pritchard等人，Nucleic Acids Res.(1997)25(17)：3403-7；Wu等人，Genomics，(1989)4(4)：560-9)，且已经广泛地用于SNP检测、酶扩增反应和DNA修复。

已经开发了许多非酶的或模板介导的化学连接方法，它们可以用于检测序列变动。这些方法包括化学连接方法，该方法使用偶联剂，诸如N-氰基咪唑、溴化氰、和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺氢氯化物。参见Metelev，V.G.，等人，Nucleosides & Nucleotides(1999)18：2711；Luebke，K.J.，和Dervan，P.B.J.Am.Chem.Soc.(1989)111：8733；和Shabarova，Z.A.，等人，Nucleic Acids Research(1991)19：4247，它们各自通过引用整体并入本文。

Kool(美国专利号7,033,753，它通过引用整体并入本文)描述了化学连接和荧光共振能量转移(FRET)用于检测遗传多态性的应用。在该方法中，读数是基于荧光强度的溶液相变化。

Terbrueggen(美国专利申请60/746,897，它通过引用整体并入本文)描述了化学连接方法、组合物和试剂用于通过微阵列检测来检测核酸的应用。