[发明专利]基因毒性测试

说明书

本发明涉及用于检测导致或加剧基因组损伤的试剂的方法，且涉及可应用于此类方法的分子和转染的细胞系。具体而言，本发明涉及用于在人细胞培养物和其他哺乳动物细胞系中检测基因组损伤的生物传感器。

基因组损伤可通过DNA损伤发生，DNA损伤由多种试剂(agent)如紫外光、X射线、自由基、甲基化剂和其他诱变化合物所诱导。基因组中染色体的数量亦可由称作非整倍体诱发剂(aneugen)的化合物所改变。DNA损伤/或非整倍体诱发作用(aneugenesis)亦可间接地由影响与DNA相互作用的酶和蛋白质(包括聚合酶和拓扑异构酶)的试剂或通过前诱变剂(promutagen)(可代谢称为诱变剂的试剂)所导致。任何这些试剂可导致对包含生物遗传密码的DNA的损伤，并导致基因中的突变。在动物中，此类染色体数量的突变或改变可导致致癌作用或可损伤配子以导致后代中的先天性缺陷。此类DNA损伤剂可统称为基因毒素(genotoxin)。

这些DNA损伤剂可化学地修饰组成DNA的核苷酸，打断连接核苷酸的磷酸二酯键，或破坏碱基之间的联系(T-A或G-C)。其他基因组损伤剂可对DNA的结构组分(例如组蛋白)，核和细胞分裂的机制(例如纺锤体形成)，或基因组维持系统如拓扑异构酶和聚合酶有作用。为了对抗这些DNA损伤剂的作用，细胞进化出了大量机制。举例而言，大肠杆菌中的SOS应答是充分表征的(well-characterized)的由DNA损伤诱导的细胞应答，其中表达了一系列蛋白质，包括DNA修复酶，该酶修复损伤的DNA。在哺乳动物中，系统如核苷酸切除修复和碱基切除修复机制在DNA损伤修复中起突出作用，并且是用于去除大量DNA加成物(adduct)和修饰的碱基的主要机制，而非同源末端连接和同源重组在链断裂的修复中是重要的。这些系统的大多数亦导致细胞周期停滞以允许细胞在进行细胞分裂之前进行修复。

在许多情况下，鉴定何种试剂可导致或加剧基因组损伤是重要的。检测导致基因组损伤的试剂在当评估将个体暴露于这些试剂是否安全时是特别重要的。举例而言，检测这些试剂的方法可用作基因毒性测定以供筛选作为候选的药物、食物添加剂或化妆品的化合物以评估目标化合物是否诱导基因组损伤。或者，检测基因组损伤剂的方法可用于监测包含诱变化合物的污染物对水源的污染。

多种用于确定试剂的基因毒性方法，如Ames测试，体外微核试验和小鼠淋巴瘤测定(MLA)是已知的，但由于多种原因，是不尽如人意的。举例而言，样品的培育(incubation)可花费许多周，而通常需要在更短的时间框架中获得基因毒性数据。此外，许多已知的检测DNA损伤的方法(包括Ames测试和相关方法)测定的是作为终点的持续DNA损伤，其为错误修复的DNA(突变和重组)的形式，或者为片段化DNA形式的未修复损伤。然而，多数DNA损伤在可测量此种终点之前即已修复，且持续DNA损伤仅在如此恶劣以致使得修复机制饱和的条件下发生。DNA损伤可经正确地修复，或不准确地修复从而创造突变。该突变终点可在DNA修复之后测得。持续DNA损伤如DNA双链断裂是致死的。

在WO 98/44149中公开了改善的基因毒性测试，其涉及包含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaie)调节元件可操作地连接于DNA序列的重组DNA分子，所述元件响应DNA损伤激活基因表达，而所述DNA序列编码发光报道基因如绿色荧光蛋白(GFP)。此类DNA分子可用于转化酵母细胞以用于供检测导致或加剧DNA损伤的试剂的存在的基因毒性测试。可对该细胞施以试剂，而来自细胞的发光报道基因(GFP)的表达表明该试剂导致DNA损伤。WO 98/44149中描述的基因毒性测试检测可防止达到终点的修复活性的诱导。WO 98/44149中描述的方法可因此用于检测DNA损伤剂的存在。

US 6,344,324公开了包含仓鼠GADD153上游启动子区的调节元件连接于编码GFP的DNA序列的重组DNA分子，所述元件响应广泛范围的细胞应激条件而激活基因表达。该报道系统实现于人头颈鳞状细胞癌细胞系中。然而，与该报道系统相关的问题为其需要在导致少于10％的细胞存活的测试剂浓度的至少四日的处理期，然后通过流式细胞计量术分析荧光。此外，用在该毒性水平的试剂测试时任何基因诱导的生物学相关性值得商榷。此外，该发展并未公开特异性监测可导致或加剧DNA损伤的试剂的存在的手段，且GADD153诱导的机制依旧不明。因此，该系统作为人DNA损伤生物传感器的作用非常有限。