[发明专利]用于治疗疾病的三环DNA反义寡核苷酸、组合物和方法

说明书

发明背景

技术领域

总的来说，本公开涉及合成的反义寡核苷酸(AON)，以及使用反义寡核苷酸改变在pre-mRNA加工期间发生的剪接事件、或下调含有重复序列例如3’或5’CUG、CAG和/或CCUG的突变mRNA的表达的方法。更具体来说，本文公开了三环DNA(tc-DNA)AON，其能够有效促进pre-mRNA加工期间的外显子跳跃、掩蔽pre-mRNA中的内含子沉默序列和/或茎-环序列、以及引导RNase介导的mRNA破坏。本文描述了这样的tc-DNA AON，通过跳过肌养蛋白基因内突变的外显子、例如突变的外显子23或外显子51以恢复肌养蛋白的功能性，可用于杜氏肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy)的治疗方法中。还描述了这样的tc-DNA AON，其通过掩蔽SMN2基因内的内含子沉默序列和/或末端茎-环序列，以产生能够至少部分补偿无功能SMN1蛋白、包含由外显子7编码的氨基酸序列的修饰的功能性SMN2蛋白，从而可用于脊髓性肌萎缩的治疗方法中。此外本文还描述了这样的tc-DNA AON，其通过引导对包含3’-末端CUG重复序列的突变DM1 mRNA的破坏，可用于Steinert肌强直性营养不良的治疗方法中。因此，tc-DNA AON以及一种或多种上述方法可用于恢复与肌病相关的蛋白的功能性。

现有技术描述

杜氏肌营养不良(DMD)是最常见的遗传性肌病，3,500名男性中约有1人患有此病，与种族无关。尽管不太常见，在显性携带者中，女孩和妇女也可表现出类似杜氏肌营养不良的症状。DMD的最主要后果是肌纤维变得特别脆，并且自然的肌肉活动就会激起肌肉组织的普遍损伤。在DMD以及许多肌营养不良中观察到的终点，是缓慢退化导致几乎完全纤维变性并伴有脂肪浸润。由于脊柱变形和呼吸困难，在1960年代时的预期寿命约为15岁。在不存在心脏并发症的情况下，现代在管理方法上的改进(即关节固定术和气管切开术通气)已经将预期寿命提高至30岁。

DMD的临床症状在18个月至三岁时变得明显，包括行走和爬行能力滞后、难以从地板上起立和小腿肚异常增大。在约5至6岁时，在足、膝和髋关节中发生肌肉收缩。疾病发展的特征是持续性肌肉消耗，导致在约9至12岁时丧失行走能力。此外，一些杜氏肌营养不良男孩表现出智力迟钝，表明缺失的蛋白也与中枢神经系统有关。

杜氏肌营养不良是X染色体连锁的隐性病。1986年，通过定位克隆方法鉴定到DMD基因座位于X染色体上(Xp21.2-OMIMid：310200)，在编码被称为肌养蛋白的蛋白的基因中。肌养蛋白基因中的突变导致在横纹肌中不能产生肌养蛋白。患病男孩的母亲有三分之二的几率携带肌养蛋白突变，而接近三分之一的双亲具有新生突变。一半以上的DMD男孩表现出涵盖一至几个外显子的大基因组缺失；他们中极少数具有大的序列重复。其他人具有难以鉴定的点突变或非常小的缺失或重复。

然而，突变的程度与表型的严重性不直接相关。产生提前终止密码子的框外缺失或无义突变以及随后翻译的失败，导致以严重表型为特征的肌养蛋白缺乏。框内缺失造成较轻的肌病，被称为贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy，BMD)。

DMD基因座具有接近250万个碱基对，是曾经检测到的最长的基因，但是只有约14,000个碱基对含有编码序列，其分布在79个外显子中。全长肌养蛋白(DP 427)是在所有肌肉中表达的427kDa的细胞骨架蛋白，但通过分别位于内含子29、43、55和62中的四个内部启动子的组织特异性的差异使用(在视网膜、中枢神经系统、外周神经系统和非肌肉组织中)，产生了各种蛋白质同工型(DP 260、DP 140、DP 116、DP 71)。

全长肌养蛋白是肌纤维膜糖蛋白复合物(SGC)的必要组分，所述复合物通过将肌纤维细胞骨架与细胞外基质相连而参与维持肌纤维膜的完整性。序列分析预测肌养蛋白需要几个结构域和重复序列。大体上说，在N-端存在肌动蛋白杂交位点(N-ABD)；含有可以赋予柔性的4个铰链区段(H)的中央杆结构域(RD；具有24个血影蛋白样重复序列)；以及靠近C-端(CT)的富半胱氨酸结构域(CRD)，其与DPC的其他成员结合。