[发明专利]用于监测细胞培养物的方法

说明书

本申请要求2009年3月10日提交的美国临时申请流水号61/158,954的权益，通过提及而将其内容完整收入本文。

发明领域

本发明涉及一种监测细胞培养物的生理学状态的方法。可以监测数项参数诸如细胞存活力、生长、代谢谱、和生产力来建立细胞培养物的代谢指纹或代谢谱。

发明背景

哺乳动物细胞培养物已经广泛用于生产治疗性蛋白质，其中复杂的翻译后修饰是必要的，以确保在患者中的功效。至今，大规模补料-分批培养仍然是治疗性蛋白质生产的主要模式(Chu等，Curr.Opin.Biotechnol.12：180-187，2001)。高密度灌注培养(Konstantinov等，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.101：75-98，2006；Konstantinov等，Biotechnol.Prog.12：100-109，1996；Trampler等，Biotechnology 12：281-284，1994)通常在不稳定性分子的情况中采用，对于所述不稳定性分子，期望在升高的生物反应器温度的最小停留时间(参见例如图1)。根据a)定量给料需求和定价压力、b)管理机构的严格蛋白质质量要求、和c)工业方法开发的进取时间线，用于治疗性蛋白质生产的最近的方法开发项目的主要目的是以高产物产率和一致的产物质量为特征的生物反应器方法的快速开发。另外，由于这些方法的制造成本较高，鉴定和使用用于细胞培养鲁棒性(robustness)的精确且灵敏的控制是期望的。这些控制可以在培养结束前提供蛋白质生产力和/或最终质量中的问题的早期警告。目前，生物反应器监测和方法改进两者都主要基于细胞生长、代谢活性、和蛋白质生存力数据。虽然有用，但是已经认识到此基于细胞比速率的办法的局限性，而且已经对细胞生理学状态的更鲁棒的表征提示了诸如准实时代谢流分析等方法(Goudar等，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.101：99-118，2006；Konstantinov，Biotechnol.Bioeng.52：271-289，1996)。

如此，明确需要开发和应用实现哺乳动物细胞培养物的生理学状态的全面表征的方法，改善用于监测过程一致性和鲁棒性的目前的常规测量组。此外，在连续过程的背景中利用容许具有多种细胞系和实验条件的实验的改进程序，这些方法可以产生较大的生理学数据集，其会增强对蛋白质生产和制造过程的总体了解。此类开发可以导致不仅是蛋白质生产力的，而且也是蛋白质质量的精确且灵敏的标志物的鉴定。随后，这些标志物可以在制造方法中使用以在培养结束前预测最终的蛋白质质量，同时它们还可以帮助改善蛋白质生产和制造方法以确保最终结果的批次间一致性。最后，这些生理学表征方法可以基于有成本效益的平台。

为了解决哺乳动物细胞培养物的生理学状态的表征，利用气相层析-质谱术(GC-MS)代谢组学来分析在高细胞密度灌注反应器中以实验室和制造规模两者培养的幼仓鼠肾(BHK)细胞。代谢组序型分析使细胞培养物的区别能够基于细胞龄、生物反应器规模和细胞来源实现，同时鉴定区别性代谢物提供的关于培养物的体内生理学状态的重要信息。因此，代谢组学是细胞培养工程中的一种有价值的分子分析工具。

附图简述

图1：细胞培养灌注系统的示意图。

图2：发酵方法的概述。连接小瓶和反应器的线标示实验室和制造规模生物反应器的接种源。

图3：反应器的活细胞密度随整个操作过程的时间谱。

图4：生物反应器的a)生物反应器存活力、b)细胞生长、c)比(specific)葡萄糖消耗率和d)比乳酸盐(lactate)生产率的时间谱。将反应器的培养过程分成10-天时间间隔，从达到稳态开始，并在时间间隔的中间时间点呈现每个时间间隔的平均值及相关的标准差。

图5：对实验室规模生物反应器的GC-MS极性代谢谱的5A.等级聚类(hierarchial clustering)(HCL)及5B.主成分分析(PCA)。这两项分析都基于该谱中的每种代谢物的标准化相对峰面积，如等式(1)中所限定的。皮尔森相关性(Pearson correlation)是HCL的距离度量。在图5A中，还描绘了3个鉴定的亚簇之每个中包括的谱的形心图。PC1、PC2、和PC3指分别由主成分1、2、和3携带的初始实验空间中的数据集的％变化。