[发明专利]具有减少的金属肽酶表达、适于重组多肽产生的突变细胞

说明书

序列表

本发明包含序列表。

技术领域

本发明涉及产生至少一种目标异源多肽的突变的细菌细胞，其中所述细胞与其他为同基因的但非突变的细胞相比，具有减少的包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平；用于产生所述突变细胞的方法；和用于使用所述突变细胞产生目标多肽的方法。

背景技术

多肽，具体而言，酶的重组工业生产，是竞争激烈的领域，其中技术水平非常之高。芽孢杆菌属(Bacillus)中多肽的工业产生尤其受到完善的研究，且目前而言，在该领域甚至稳步改善多肽产率或生产力也是需要的。

长年以来已知在芽孢杆菌属中胞外和细胞壁相关蛋白酶的失活在许多情况下导致改善的产物稳定性并因此导致更佳的产率(WO 1992/016642)。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600株中失活了多至六种的蛋白酶(Wu等1991.Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a strain deficient in six extracellular proteases.J Bacteriol 173(16)：4952-4958)。

SEQ ID NO：1中所示的开读框(ORF)编码表示为BL00829的推定的金属蛋白酶，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：2(NCBI“Entrez Protein”或“Entrez Gene”登录号：YP_080660)，其为最初从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC14580的基因组测序中由Rey等在2004：Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species，Genome Biol.(10)：R77所预测的。据我们所知，在此之后尚未公开任何关于该预测的ORF或推定的编码的金属蛋白酶活性的研究。

发明内容

在几种地衣芽孢杆菌酶产生株中SEQ ID NO：1中所示的推定开读框的失活导致显著改善的酶产率，如实施例中所示。宿主株已经失活了两个主要的胞外蛋白酶，即碱性和中性蛋白酶(apr，npr)，以及C-组分(BLC)。这些失活目前(by far)消除了胞外细胞膜活性的主要部分(＞90％)。

预期失活仍旧另一个蛋白酶会至多(at best)提供仅为非常次要的改善。鉴于此，如实施例中所见，失活本发明的推定的金属蛋白酶导致如此显著改善的产物产率是非常令人惊讶的。

相应地，在第一个方面，本发明涉及突变的细菌细胞，其产生至少一种目标异源多肽，其中所述细胞与其他为同基因但非突变的细胞(otherwise isogenic but non-mutated cell)相比，具有减少的包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同，或优选与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平。

本发明的第二个方面涉及用于构建突变的细菌细胞的方法，所述方法包括下述步骤：a)使细菌细胞突变；和b)选择突变细胞，其与其他为同基因但非突变的细胞相比，具有减少的包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同，或优选与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平。

本发明的最后一个方面涉及用于产生目标异源多肽的方法，所述方法包括下述步骤：a)培养产生至少一种目标异源多肽的突变细菌细胞，其中所述突变细胞与其他为同基因但非突变的细胞相比，具有减少的包含与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％相同，或优选与SEQ ID NO：2至少75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽的表达水平，和b)分离目标多肽。

附图说明

图1显示质粒pMDT081的概略图。

图2显示质粒pAN829的概略图。

图3显示质粒pMOL2598的概略图。

图4显示质粒pMOL2606的概略图。

图5显示质粒pAN369的概略图。

图6显示质粒pAN405的概略图。