[发明专利]筛选胰岛素分泌增强剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及筛选胰岛素分泌增强剂的方法，且更具体地涉及荧光标记的Epac2基因、该基因转化的细胞和利用此类细胞筛选胰岛素分泌增强剂的方法。

背景技术

硫酰脲类(下文称作“SU剂”)广泛用作糖尿病治疗剂，己知其通过结合SU受体(SUR1)显示其效果，所述SU受体是ATP敏感性K⁺通道(K_ATP通道)的组分和调节亚基(非专利文件1-3)。K_ATP通道存在于胰腺β细胞的细胞膜上并通过其打开和关闭调节待分泌的胰岛素量。SU剂对所述SU受体的结合诱导胰腺β细胞表面的K_ATP通道关闭，这引发了细胞膜的去极化。这随之引起电压依赖性Ca²⁺通道打开以允许Ca²⁺流入细胞，从而增强胰岛素分泌。SU剂的例子包括甲苯磺丁脲，格列本脲，氯磺丙脲，格列齐特等。

多种细胞内信号参与调节胰岛素分泌机制。具体地，细胞内产生的cAMP作为非常重要的信号分子行使调节胰岛素分泌细胞的功能。已知在通过cAMP引起的胰岛素分泌的调控机制内有两类通路，为蛋白激酶A依赖性通路和独立性通路。在蛋白激酶A独立性通路中，由Epac 2介导的通路是已知的(通过cAMP直接激活交换蛋白：由cAMP激活的小G蛋白Rap1的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF))(非专利文献4-6)。cAMP直接结合激活的Epac2有Rap1鸟嘌呤核苷酸交换活性，该活性激活Rap1，从而促进胰岛素分泌。

如上所述，虽然有多种调节胰岛素分泌的机制，但对糖尿病治疗剂(包括SU剂)的作用机制尚未完全阐明。

Epac2有一个与其结构相似的同种型(Epac1)(非专利文献7)。Epac1有cAMP结合结构域，蓬乱蛋白(Dishevelled)，Egl-10，普列克底物蛋白(DEP)结构域(该结构域起着Epac1膜定位的作用)，Ras交换基序(REM)，和位于羧基末端的GEF结构域。除具有上述结构域外，与Epac1结构相似的Epac2还具有位于其氨基端的第二cAMP结合结构域和与Ras相互作用的Ras相关(RA)结构域。Epac1和Epac2都通过cAMP参与胞内信号传输。

为了监测细胞内的通过cAMP的信号传输，已开发了作为荧光共振能量转移(FRET)传感器的融合蛋白，该蛋白监测Epac1在活细胞内的活化，在所述蛋白内部分或全长Epac1夹在发出不同颜色荧光的两种其他蛋白之间，即青色和黄色荧光蛋白(非专利文献8-10)。

“FRET”是这么一种现象，当彼此接近的两种(供体)染料分子之一，如荧光蛋白，被有一定波长的光(激发光)辐照以激发该染料分子时，激发能量通过电子之间的共振被转移到接近的另一个染料分子(受体)上。根据这一现象，通过由供体吸收的光能，所述受体发出一定波长的光(荧光)。因此，所述FRET技术是一种检测由FRET引发的荧光变化的方法。

当用青色荧光蛋白(发出波长较短的荧光)的激发光(波长：约440nm)照射由青色和黄色荧光蛋白和夹在它们之间的部分或全长Epac1(荧光标记Epac1)组成的融合蛋白时，该蛋白被激发，并利用部分所述激发能量发生FRET，黄色荧光蛋白也被激发并发出波长为535nm的荧光。另一方面，所述青色荧光蛋白的部分激发能量不引发FRET，但该青色荧光蛋白发出波长为480nm的荧光。因此，由所述荧光标记的Epac1发出的两种不同波长的荧光的强度比率(535nm波长的荧光强度/480nm波长的荧光强度)取决于该分子内青色和黄色荧光蛋白的构象和之间的距离。因此，当由于一些修饰或与别的分子结合导致上述分子构象变化时，所述比例也发生相应的变化。由于荧光标记的Epac1的高级结构发生变化(如当cAMP结合该分子时)，通过FRET技术对该变化的检测能够检测cAMP分子是否与Epac1结合。因此，当用波长440nm的光照射荧光标记的Epac1时，通过检测利用FRET技术发出的荧光强度的变化，可以检测通过Epac1的信号传输是否存在。

虽然如上所述已知在FRET技术中用Epac1作为传感器(FRET传感器)来测量信号传输的方法，但尚不知利用全长Epac2作为FRET传感器的方法。