[发明专利]扩增富含GC的DNA模板的方法

说明书

本发明在DNA合成的领域中，具体地涉及牵涉富含GC的模板和产物的合成。

从第一次分离DNA聚合酶并确定可以在体外合成DNA的条件起，DNA合成反应已经广泛用于生物技术、医学、和研究应用中的制备和分析目的。聚合酶链式反应或PCR是一类可以快速且指数性扩增DNA序列的DNA合成反应。与其它循环的合成反应一样，它牵涉以循环方式重复复制目标序列。PCR的典型的执行牵涉提供与期望的序列的末端互补的引物、合适的缓冲液、镁盐、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、和嗜热性DNA聚合酶。将在例如基因组DNA样品内含有的模板或目标DNA暴露于水溶液中的这些组分。经由不同温度的步骤来使混合物循环，所述温度促进模板的变性、引物与模板的退火、然后通过聚合酶延伸引物，产生更多的产物。因为每轮循环的产物可用作后续反应中的模板，产物的量大致以指数增加，直至耗尽其它反应组分(最初过量存在)。参见例如美国专利4,683,202；M.J.McPherson和S.G.Moller，PCR：The Basics(第2版，Taylor和Francis)(2006)。

PCR及循环核酸合成反应的其它形式是在分子生物学、生物技术中以及日益在医学中的一项标准工具。PCR及相关技术的关键优点是快速、低成本、灵敏性、对高通量分析的适应性、和通用性。扩增仅需要几小时或更少，小的个别反应可能花费价值完全不到1美元的试剂，所需要的模板量通常在毫微克范围中，自动化可以导致每台自动仪器每天运行数千次反应，并且引物可以设计为扩增几乎任何序列。

对分析和制备应用两者广泛采用PCR及相关技术。PCR的典型制备应用是扩增序列，使得它可以在异源载体中克隆。此应用的特殊化变型是诱变PCR，其中有意降低反应的保真性以生成含有突变的目标序列的拷贝。然后，可以在下游研究或实验中使用克隆的突变体拷贝。诱变PCR可以通过使用有偏向的dNTP集合来实现，其中dATP、dCTP、dGTP、和dTTP不以等摩尔比率存在。这可以提高PCR循环的延伸步骤期间掺入错配的频率，产生突变体产物。参见例如PCR Methods增刊2：28-33(1992)；Anal Biochem 224：347-353(1995)。

虽然已经在上文所描述的有意地易错PCR中使用不平衡的dNTP集合，但是此类不平衡的诱变效果在其它应用中得不到赞同。诱变一般在分析应用中以及在突变体产物不是目标的制备应用中是不利的。实际上，突变体产物一般不合需要已经激发通过修饰聚合酶或其它反应组分来表征和提高反应诸如PCR的保真性的努力。参见例如Nucleic Acids Research，24：3546-3551(1996)；美国专利7,030,220；美国专利6,881,559。此外，预期与不平衡的dNTP集合有关的错误率增加会限制反应产率，这是因为错配降低DNA聚合酶的持续合成能力(processivity)和掺入率两者。

PCR的显著的分析应用是在诊断疾病或确定涉及具有大小多态性的遗传基因座的基因型。

展现出医学相关大小多态性的基因座的例子是X染色体上的人FMR1基因的5’非翻译区(UTR)。正常的个体在此区域中通常具有5-44个CGG重复。相反，含有200至2000或更多个CGG重复的此基因座的等位基因指示脆性X综合征(Fragile X syndrome，FXS)。此类等位基因称为全突变等位基因。这些等位基因是遗传不稳定的。患有FXS的个体可以具有诸如共济失调、卵巢功能早衰、学习无能、和其它认知/行为状况(包括孤独症样症状)等综合征的多种组合。