[发明专利]用于检测和鉴定超广谱β-内酰胺酶的方法

说明书

相关申请 

本申请要求由Lippe等人于2009年2月19日提交的美国临时申请序列号61/153,954的优先权，其发明名称为“用于检测和鉴定超广谱β-内酰胺酶的方法”，将其全部内容引入本文作为参考。 

对序列表的参考 

本申请与电子形式的序列表一同提交。序列表以名称为GENOM.097VPC.txt的文件提供，该序列表生成于2010年2月18日，大小为15.2KB。将电子形式的序列表中的全部信息引入本文作为参考。 

本发明的背景 

技术领域

本发明公开的实施方式涉及分子诊断，并且尤其是涉及用于检测和鉴定携带有超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的微生物的诊断，并且尤其是涉及用于检测和鉴定携带有CTX-M基因的微生物的诊断。 

背景技术

β-内酰胺酶对于β-内酰胺药物具有抗性。这些酶破坏β-内酰胺抗生素的β-内酰胺环，所述β-内酰胺抗生素例如青霉素、头孢菌素、头霉素和碳青霉烯(厄他培南(ertapenem))。这些抗生素在它们的分子结构中具有共同的单元：被称为β-内酰胺的四原子环。内酰胺酶破坏该环，使之开环，使所述分子的抗菌性质失活。 

超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamase，ESBL)日益成为全球出现的医院感染的原因，并还令人担忧地成为公共问题的原因(Rossolini等，2008，CMI)。ESBL是水解具有氧亚胺基侧链的超广谱头孢菌素的β-内酰胺 酶。这些头孢菌素包括头孢噻肟、头孢曲松和头孢他啶，以及氧亚胺基单环内酰胺氨曲南。因此，ESBL对于这些抗生素和相关的氧亚胺基β-内酰胺类具有抗性。最为公众所知的ESBL来自于TEM-1、TEM-2或SHV-1基因，并包括改变这些β-内酰胺酶的活性位点附近的氨基酸的构型的突变。这扩展了易受这些酶水解的β-内酰胺抗生素的范围。 

TEM和SHV典型变种例如TEM和SHV，在影响了欧洲大部后，目前正在美国迅速蔓延，而一种新型的ESBL，即CTX-M，则流行于南美、地中海和西欧国家(Govinden等，2007，AJB)。在20世纪80年代晚期的日本、欧洲和阿根廷，特别是在1989年的德国，发现了最新的变种，可将其名字归因于其对于头孢噻肟的高的抵抗活性(Naas等，2008，CMI)。其被认为是所有变种中最有影响的组(Rasmussen和Hoiby，2004，CJM)。它的出现可能是增加头孢曲松和/或头孢噻肟的使用以治疗细菌感染的结果，已知其来源于克罗非菌属的成员中的基因。到目前为止，根据Lahey Clinic网站(可登陆万维网址lahey.org/Studies)，已经记载了超过85种CTX-M衍生物，其可以分成5个种系组(phylogenetic group)(CTX-M-I、2、8、9和25)。 

CTX-M抗性基因发现于肠杆菌科，其可以轻易地穿透物种之间的质粒。包括肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌等在内的具有CTX-M基因的肠细菌种被认为是尿路感染的主要原因。其它的肠杆菌科，例如阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌、产气肠杆菌以及产酸克雷伯杆菌，也可以携带CTX-M基因。检测CTX-M抗性品系特别关键，因为需要与医院中的其他病人隔离，并且仅剩下碳青霉烯作为感染的主要治疗手段。 

直到最近，获知品系抗性的唯一途径是进行手工抗微生物敏感性试验。敏感性试验有很多缺点，包括需要大量的时间获得结果，即48～96小时。首先，操作者需要从样本中分离出菌株，这可能需要48小时；然后，继续进行生化鉴定，这又需要18～24小时；然后进行手工抗微生物敏感性试验，这可能还需要占用24小时。除了在获得结果上的延误外，手工试验方法还遭遇其它问题，例如，由于抗生素盘的不适当储存和抗生素盘的不适当扩散造成的缺乏重现性，以及缺乏标准化方法。