[发明专利]来自生物的生理活性物质的测定方法、用于实施该测定方法的程序以及来自生物的生理活性物质的测定装置

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测含有来自生物的生理活性物质的样品中的该生理活性物质或测定其浓度的测定方法和测定装置，所述生理活性物质具有通过与LAL的反应而发生凝胶化的特性，如内毒素、β-B-葡聚糖。

背景技术

内毒素是存在于革兰氏阴性菌的细胞壁中的脂多糖，是最有代表性的致热原。如果被该内毒素污染的输液、注射药、血液等进入人体，则可能引起发热、休克等严重的副作用。因此，需要管理上述药物等以使其不被内毒素污染。

在鲎(カブトガニ)的血细胞提取物(以下也称为“LAL：鲎变形细胞溶解物”)中存在被内毒素激活的丝氨酸蛋白酶。并且在LAL与内毒素反应时，根据内毒素量而激活的丝氨酸蛋白酶产生酶级联，由此，存在于LAL中的凝固蛋白原被水解成凝固素，凝固素缔合生成不溶性的凝胶。利用该LAL的特性，可以高灵敏度地检测内毒素。

另外，β-D-葡聚糖是构成真菌中特征性细胞膜的多糖。通过测定β-D-葡聚糖，不仅在如念珠菌(Candida)、スペルギルス(Spergillus)、隐球菌(Cryptococcus)的一般临床中常见的真菌中，而且在也包含稀有真菌的广范围内对于真菌感染病的筛选等是有效的。

在β-D-葡聚糖的测定中，也利用鲎的血细胞提取成分通过β-D-葡聚糖凝固(凝胶凝固)的特性，可以高灵敏度地检测β-D-葡聚糖。

对这种内毒素、β-D-葡聚糖等可由鲎的血细胞提取成分检测的来自生物的生理活性物质(以下也称为规定生理活性物质)进行检测或浓度测定的方法有比浊法，其中将要进行规定生理活性物质的检测或浓度测定(以下也简称为“规定生理活性物质的测定”)的样品与LAL混合所得的混合液静置，LAL与规定生理活性物质的反应导致凝胶的生成，随时间测量伴随凝胶生成的样品浊度进行分析。

在通过上述比浊法进行规定生理活性物质的测定的情况下，在经干热灭菌处理的玻璃制测定池内生成测定样品与LAL的混合液。然后，从外部对混合液的凝胶化进行光学测定。但是，在比浊法中，特别是在规定生理活性物质的浓度低的样品中，存在LAL发生凝胶化需要很长时间的情况，因此，需要可进行规定生理活性物质的短时间测定的方法。

针对该需求，提出了激光散射粒子测量法(以下简称为光散射法)，该方法是用例如磁性搅拌子来搅拌测定样品与LAL的混合液，由此生成凝胶微粒，可在短时间内由凝胶粒子散射的激光强度、或者透过混合液的光强度测定样品中规定生理活性物质的存在；或者，提出了搅拌比浊法，该方法虽然是比浊法的一个方案，但是其搅拌测定样品，使混合液中凝胶化的状态均匀而促进反应。比浊法和搅拌比浊法是检测光透射率，光散射法是检测生成的粒子，在这点上它们有所不同，但它们均以阈值法作为判定的基础，该阈值法测量由混合液的透射光强度或散射光强度或峰数目求出的粒子数目超过阈值所需的时间。

另外，还有预先加入针对添加到试剂中的凝固酶的合成底物，对被凝固酶分解的合成底物显色、或者发出荧光、以及发光的现象进行测定的方法，利用显色的方法作为比色法、和作为规定生理活性物质定量法中的重要测定方法之一得到广泛应用。

上述测定法中观察到以下的现象：在比浊法和搅拌比浊法中，测定开始后即刻，与规定生理活性物质和LAL的反应(以下也称为鲎反应)的状态无关，透射光强度减少；在光散射法中，散射光强度或峰数目升高(以下将该现象也称为逐渐减少/升高)。该逐渐减少/升高对于上述测定方法中由透射光的强度或散射光的强度或峰数目求出的粒子数超过阈值所需的时间有影响，因此可能使上述测定方法的测定精度降低。上述测定方法中，规定生理活性物质的浓度越低，则由透射光的强度、或者散射光的强度或峰数目求出的粒子数超过阈值所需的测定时间越长，因此规定生理活性物质的浓度越低，越容易受逐渐减少/升高的影响，可能无法正确评价凝胶化或凝集开始的反应起始时刻。

如上所述，判定凝胶化或显色的手段是利用阈值法或微分法等，阈值法是以由于凝胶化或显色而变化的物理量达到预先设定的阈值以上或者超过阈值的时间点(以下简称为通过阈值的时间点)作为反应起始时间；微分法是以给定时间内光透射率或吸光度的变化量的大小为基准。采用阈值法时，已知样品中规定生理活性物质的量与反应起始时间的关系在双对数下是负斜率的直线关系。另外，光透射率或吸光度等由于凝胶化或显色而变化的物理量的时间变化曲线可近似于logistic 曲线。因此，与低浓度的规定生理活性物质反应时可见非常缓慢的变化，与高浓度规定生理活性物质反应时可见急剧的变化。因此，在任何反应中均采用同一阈值来确定反应起始时间时，阈值法的不便之处在于对低浓度样品的测定时间延长。