[发明专利]干化学层中具有低活性的酶的快速反应动力学

说明书

本发明涉及一种用于测定分析物的方法及其合适诊断元件。

诊断元件是临床相关分析方法的重要组成部分。就此而论，主要焦点在分析物（例如代谢产物或底物）的测量上，其例如借助于对分析物特异的酶进行直接或间接的测定。在这种情况下，借助于酶-辅酶复合物将分析物转化，并且随后进行定量。在这个过程中，将待测分析物与合适的酶、辅酶和任选的介质接触，辅酶通过酶促反应（例如氧化或还原）发生物理化学变化。如果另外使用介质，这种介质通常在分析物反应期间将释放的电子从还原的辅酶转移到光学指示器或电极的导电组分，这样的话可以例如通过光度测定或电化学检测所述过程。校准提供测量值和待测分析物浓度之间的直接关系。

现有技术已知的诊断元件的特征在于有限的保存期限和对环境的特殊要求，例如冷却或干储存，以便实现所述保存期限。因此，在某些应用形式下，例如由最终用户自己实施的检验（诸如血糖自我监控）的情况下，错误的结果可能归因于错误的、被忽视的测量系统的不正确保存，这几乎不能被消费者识别，并且可能导致相应疾病的错误治疗。错误的结果主要源于以下事实：用于这类诊断元件的酶，辅酶和介质通常对水分和热产生敏感反应，并随时间而失活。

用于增加诊断元件稳定性的已知措施是使用稳定的酶，例如使用来自嗜热生物的酶。此外，可以通过化学修饰具体来说是交联来稳定酶。此外，还可以添加酶稳定剂诸如例如海藻糖，聚乙烯基吡咯烷酮和血清白蛋白，或可以在聚合物网络中例如通过光聚合而封入酶。

另一种稳定酶的方法是通过位点特异性或非位点特异性引入的突变。就此而论，通过编码酶的DNA的靶向变化来特异性影响相应酶性质的重组技术的使用经证明是特别合适的。

Baik等(Appl. Environ. Microbiol (2005), 71, 3285)描述了来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)葡糖脱氢酶的3种突变体(包含氨基酸取代E170K，Q252L或E170K/Q252L)的分离和表征。突变体E170K和Q252L在低盐浓度和高pH值下只具有低稳定性，而双突变体在检测条件下显示显著增加的稳定性，这归因于二聚体-二聚体界面上增强的相互作用。

Vázquez-Figueroa等(ChemBioChem (2007), 8, 2295)公开了一种热稳定葡糖脱氢酶的开发，其包括在来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的葡糖脱氢酶的第155，170和252位引入氨基酸取代。就此而论，据称突变E170K和Q252L，单独以及组合的，导致来自枯草芽孢杆菌的葡糖脱氢酶的稳定。

但是，当使用与野生型变体相比稳定的酶（经遗传修饰）时，问题在于它们通常具有显著低于对应野生型酶的活性，从而造成每单位时间的更低底物转换。如果考虑到在临床和诊断化学（诸如血糖的检测）中优选使用具有高比活性的酶，通常无法接受使用稳定酶作为使用天然酶的替代。

另一个困难是，在各种情况下与每单位时间的高底物转换相关的高酶活性通常只能由相应的天然辅酶来实现。如果使用人工辅酶替代天然辅酶，则酶活性通常急剧降低，底物的转换速率从而减少。

因此作为本发明基础的目标是提供一种稳定的诊断元件，具体来说用于测定葡萄糖，其中现有技术的缺点被至少部分消除。具体来说，诊断元件应当确保底物的高转换速率，并同时确保酶以及辅酶的高稳定性。

根据本发明这个目的通过一种测定分析物的方法来实现，包括步骤∶ 

(a)将包含分析物的样品与包括干试剂层的诊断元件接触，所述干试剂层包含 

   (i)对分析物特异的突变脱氢酶和 

   (ii)人工辅酶，和 

(b)测定所述分析物的存在或/和量。

出人意料的，在本发明范围内发现，比色皿试验中在人工辅酶存在的条件下具有极低活性的突变脱氢酶，在具有干试剂层（诸如测试条）的诊断元件中显示更快的动力学，并产生与天然辅酶（野生型辅酶）存在的条件下至少一样高的转换。其原因推定是由于以下事实：成分的高浓度而不是酶的活性对转换速率有决定性影响，就此而论，酶、辅酶、还原的辅酶、分析物和氧化的分析物之间的复合物形成状态看起来是特别重要的。