[发明专利]干化学层中具有低活性的酶的快速反应动力学

权利要求书

1.用于测定分析物的方法，包括步骤∶ 

(a)将包含分析物的样品与包括干试剂层的诊断元件接触，所述干试剂层包含 

  (i)对分析物特异的突变脱氢酶和 

  (ii)人工辅酶，和 

(b)测定所述分析物的存在或/和量。

2.权利要求1的方法，其特征在于所述诊断元件中的分析物转换速率等于或高于包括相应的野生型辅酶以替代人工辅酶的相应诊断元件中的分析物转换速率，尤其是高至少20%。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于使用突变的脱氢酶，与相应的野生型脱氢酶相比，所述突变的脱氢酶具有降低的酶比活。

4.权利要求1到3中任一项的方法，其特征在于使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)-依赖性或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)-依赖性突变的脱氢酶作为突变的脱氢酶。

5.权利要求1到4中任一项的方法，其特征在于使用突变的葡糖脱氢酶（EC 1.1.1.47）作为突变的脱氢酶。

6.权利要求5的方法，其特征在于所述突变的葡糖脱氢酶包括相应野生型葡糖脱氢酶的氨基酸序列第170位或/和第252位的突变，尤其是第170位和第252位的突变，其中第170位的突变优选的包括谷氨酸对精氨酸或赖氨酸的氨基酸取代，尤其是对赖氨酸，或/和第252位的突变优选的包括赖氨酸对亮氨酸的氨基酸取代。

7.权利要求5或6的方法，其特征在于所述突变的葡糖脱氢酶是通过来自巨大芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，尤其是来自枯草芽孢杆菌，的野生型葡糖脱氢酶的突变获得的葡糖脱氢酶。

8.权利要求5到7中任一项的方法，其特征在于所述突变的葡糖脱氢酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

9.权利要求1到8中任一项的方法，其特征在于人工烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)化合物，人工烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)化合物或式(I)的化合物 

被用作人工辅酶。

10.权利要求1到9中任一项的方法，其特征在于通式(II)的化合物或其盐或任选的其还原形式被用作人工辅酶∶ 

其中

A = 腺嘌呤或其类似物， 

T = 每种情况下独立的表示O、S， 

U = 每种情况下独立的表示OH, SH, BH₃^-, BCNH₂^-,

V = 每种情况下独立的表示OH或磷酸基，或形成环状磷酸基的2个基团；

W = COOR, CON(R)₂, COR, CSN(R)₂，其中R在每种情况下独立的表示H 或C₁-C₂ 烷基,

X¹,X² = 每种情况下独立的表示O, CH₂, CHCH₃, C(CH₃)₂, NH, NCH₃,

Y = NH, S, O, CH₂,

Z = 是线性或环状有机残基，

条件是Z和吡啶残基不通过糖苷键连接。

11.权利要求1到10中任一项的方法，其特征在于carbaNAD被用作人工辅酶。

12.权利要求1到11中任一项的方法，其特征在于测试带，测试盘，测试垫，测试条或测试条筒被用作诊断元件。

13.权利要求1到12中任一项的方法，其特征在于通过光度测定或荧光测定来测定分析物的存在或/和量。

14.用于测定分析物的诊断元件，包括干试剂层，其包含 

(a)对分析物特异的突变脱氢酶，和 

(b)人工辅酶。

15.权利要求14的诊断元件，其特征在于所述突变的脱氢酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。