[发明专利]靶基因组序列富集的方法和系统

说明书

发明领域

本发明提供用于富集靶基因组序列的方法和系统。具体地讲，本发明提供在杂交测定的杂交期间通过去除靶基因组中的非靶核酸序列而进行靶核酸序列的富集。

发明背景

核酸微阵列技术的出现使人们有可能在很小的区域例如在显微镜载玻片上建立起数以百万计的核酸序列的阵列(例如美国专利号6,375,903和5,143,854)。最初，通过将预合成的DNA序列点样到载片上而产生这样的阵列。然而，美国专利号6,375,903所述的无屏蔽阵列合成仪(maskless array synthesizer，MAS)的建立现已允许直接将寡核苷酸序列在载片自身上原位合成。

使用MAS仪器，对要在微阵列上建立的寡核苷酸序列的选择是在软件控制下进行，这样能根据研究人员的具体需要而分别创建用户定制的阵列。一般而言，基于MAS的寡核苷酸微阵列合成技术允许在标准显微镜载玻片的很小区域上平行合成几百万个独特寡核苷酸元件(feature)。随着上百种生物的全基因组的可用性(其参考序列通常已经保存在公共数据库中)，微阵列已经用于对分离自大量生物体的核酸进行序列分析。

核酸微阵列技术已用于研究和诊断的许多领域，例如基因表达和发现、突变检测、等位基因和进化序列比较、基因组作图、药物发现等。许多应用需要跨整个人类基因组搜索遗传变体和突变，它们是人类疾病的基础。就复杂疾病而言，这些搜索通常导致疾病和/或疾病危险相关的单核苷酸多态性(SNP)或SNP组。鉴别这样的SNP被证明是费力的而且经常是毫无结果的工作，因为需要对来自患病个体或组织样品的大区域基因组DNA(经常大于100千碱基(Kb))进行测序，以找到一个碱基变化或鉴别所有的序列变体。其它应用包括鉴别染色体序列的得失，其也可能与例如以下癌症相关：淋巴瘤(Martinez-Climent JA等，2003，Blood 101：3109-3117)、胃癌(Weiss MM等，2004，Cell.Oncol.26：307-317)、乳癌(Callagy G等，2005，J.Path.205：388-396)和前列腺癌(Paris，PL等，2004，Hum.Mol.Gen.13：1303-1313)。同样，微阵列技术对于科学研究人员和临床医生了解疾病和治疗疾病的治疗方案的功效而言是一种特别有用的工具。

基因组通常过于复杂，无法对进行整体研究，而且必须使用降低基因组复杂度的技术。针对这个问题，一种解决方法就是将DNA样品中某些类型的大量序列减少，正如美国专利6,013,440中所述。替代方案使用例如以下文献所述的用于富集基因组序列的方法和组合物：Albert等(2007，Nat.Meth.，4：903-5)，Okou等(2007，Nat.Meth.4：907-9)，Olson M.(2007，Nat.Meth.4：891-892)，Hodges等(2007，Nat.Genet.39：1522-1527)和美国专利申请序列号11/638,004、11/970,949和61/032,594。Albert等人公开了以用户定义的方式，既合算又快速地有效减低基因组样品复杂度的替代方案，以允许进一步处理和分析。Lovett等人(1991，Proc.Natl.Acad.Sci.88：9628-9632)也描述了使用细菌人工染色体(BAC)进行基因组选择的方法。通过先实施靶序列富集，再进行测序而降低基因组的复杂度，远胜过仅单独测定杂交事件。杂交事件允许在微阵列或溶液中进行任何物种的杂交；靶序列和非靶序列都同样如此。通过实施复杂度降低和序列富集，研究人员提高了对靶序列(例如作为测定焦点的那些序列)的捕获，同时减少了所捕获的非靶序列(例如并非测定焦点的那些)的量。

然而，涉及任何杂交测定的一个问题就是在靶核酸杂交期间，在阵列上或溶液中的非靶(例如重复)核酸序列的交叉捕获事件，也称为非靶核酸序列的次级捕获(secondary capture)。次级捕获使得在杂交测定中降低复杂度的效率下降，事实上潜在地使非靶捕获干扰了所需靶捕获，导致靶捕获效率降低。目前的方法是通过向杂交测定中加入基因组封闭剂DNA(例如C₀t-1DNA)而抑制次级捕获。如果没有额外DNA加入到实验中，这将是优选的，但目前的实践不提供该可选方法。

同样，需要的是用于处理杂交测定中的次级捕获的方法，即通过不包括加入不需要的核酸、而同时又能提高靶核酸捕获效率的替代方法，用于研究工作。

发明概述