[发明专利]用于在植物中表达的多结构域酶的修饰

说明书

相关申请

参考电子提交的序列表

该序列表的官方副本是通过EFS-Web以ASCII格式的序列表以2010年1月13日生成的名为“72196WO Sequence Listing.txt”的文件进行电子提交的，并且该序列表的大小为95千字节并且与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式文件中的序列表是该说明书的一部分，并且通过引用以其全文结合在此。

发明领域

本发明涉及植物分子生物学，特别地涉及用于在植物中增加一种蛋白质的表达和/或活性的方法和组合物。

发明背景

近十年来，已经设计了多种异源表达系统用于生产临床上和农艺学上有用的重组蛋白。在大多数系统中的重要挑战在于优化重组蛋白产物的产率和质量。近15年来，在植物的转基因转录和翻译的优化方面(Potenza et al.，2004，In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant，40，1-22；Streatfield，2007，Plant Biotechnol.J.5，2-15)、以及植物细胞结构的复合体蛋白翻译后修饰特征的说明和调节方面(Gomord and Faye，2004，Curr.Opin.Plant Biol.7，171-181；Faye et al.，2005，Vaccine，23，1770-1778)已经实现了显著的进展。尽管实现了这些进展，确保重组蛋白的令人满意的产率和质量通常仍然是困难的任务。

强烈影响重组蛋白质量和产率的一个因素是在一种异源环境中表达的多肽链的相对固有稳定性(Faye et al.，2005)。

蛋白水解酶，或蛋白酶，通过指导在关键调控过程中涉及的蛋白质的活化或水解、或通过促成错误折叠蛋白的消除和来自短寿蛋白的氨基酸的选择性再循环而促成代谢和转导途径的总体控制(Vierstra，2003，Trends Plant Sci.8，135-142；Schaller，2004，Planta，220，183-197)。在植物中，这些酶还启动了开始衰老的器官中的一般的蛋白质再循环以及在发芽期间的种子或块茎贮存蛋白的氨基酸组分的动员(Müntz，2007，J.Exp.Bot.58，2391-2407)。

在植物体内的蛋白表达过程中以及在植物体外的提取和后续下游加工过程中两者，蛋白酶可能影响不同途径中的重组蛋白的完整性(Michaud et al.，1998，Methods Biotechnol.3，177-188；Rivard et al.，2006，Plant Biotechnol.J.4，359-368)。取决于用于肽键水解的对于内源蛋白酶可接近的“敏感的”切割位点的数目，该蛋白质可能经历直接影响其最终产率的完全水解或部分修整，这改变了最终蛋白产物的活性或均质性。虽然以净蛋白水平的方式可以获得感兴趣的产率，最终产物可能显示改变的完整性、结构不均匀性和/或不足的生物活性，这潜在地改变了它的商业化价值(Faye et al.，2005)。

发明概述

在此提供了用于在植物中表达修饰的多结构域酶的组合物和方法。这些组合物包括表达一种修饰的多结构域酶的植物、种子、植物组织、以及植物部分，其中该多结构域酶的组成为：至少一个第一结构域、至少一个第一连接序列、以及至少一个第二结构域。该修饰的多结构域包括异源连接区域，当修饰的多结构域酶表达在植物中时，该区域不被切割。进一步提供了用于生产一种修饰的多结构域酶的方法，包括将表达这种修饰的多结构域酶的植物进行培养。

包含本发明的表达构建体的转基因植物或植物材料的下游用途包括农艺学用途、药物用途、以及工业用途，例如人类食品、动物饲料、生物燃料、工业酒精、发酵原料、以及类似物。

发明详述

概述

本发明是针对用于转基因表达多结构域酶的植物的用途。高等植物特别有用于异源蛋白的生产，这是由于植物易于进行大规模生产，它们不像细菌重组蛋白生产系统一样需要无菌状态，并且在植物中由转基因编码的蛋白质的水平可以超过总蛋白含量的1％。迄今为止，在植物中已经成功表达了一些商业上感兴趣的蛋白质，包括多种抗体、疫苗抗原、蛋白质变应原、酶以及酶抑制剂、凝血因子、细胞因子以及激素。然而，表达高水平的稳定的并且功能性蛋白仍然是许多科学和生物技术意图(包括生产用于农业和治疗目的的蛋白质)的瓶颈。