[发明专利]包含小麦醇溶蛋白序列的多核苷酸及其在RNAi沉默中的用途

说明书

本发明涉及通过干扰RNA(iRNA)对硬小麦和面粉α、β、γ、ω醇溶蛋白的特异性沉默，其通过使用能转录成hpRNA(发夹RNA)的多核苷酸进行。此外，本发明还涉及包含所述多核苷酸的载体、细胞、植物或种子，其通过基因表达调控序列，例如γ醇溶蛋白基因的启动子或编码D-大麦蛋白基因的启动子在小麦种子的特定组织中进行表达。

现有技术

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的信使RNA降解系统，其允许特定基因的特异性沉默。该技术的发现使得可以设计包含启动子和终止信号的载体，其包含希望沉默的基因序列，并具有由不同长度间隔序列分隔的正义和反义序列。

SiRNA(小干扰RNA或短干扰RNA的英文缩写)是21-25个核苷酸(nt)的双链RNA(dsRNA，双链RNA的英文缩写)，其来源于较长的前体dsRNA。前体dsRNA可以是内源性的，此时为miRNA(机体基因组中编码)，或外源性的(例如病毒或转基因)。siRNA和miRNA均是iRNA(干扰RNA)的类型。iRNA抑制由所述iRNA识别的特定mRNA(信使RNA的英文缩写)的转录后表达。

当由外源性转基因、病毒剂或内源性遗传元件产生的dsRNA前体(单链RNA不具有该效应)进入细胞时，其通过酶作用片段化成siRNA，所述酶是指Dicer，一种RNAse III家族的细胞质酶。Dicer将dsRNA裂解成约21-25个核苷酸的双链片段(siRNA)，5’端磷酸化，3’端有两个未配对的核苷酸。在siRNA的两条链中，只有一条被称为引导链的被整合到酶复合物RISC(RNA-诱导沉默复合物)中，而另一条链被降解。siRNA5’端的热力学性质决定两条链中哪条被整合到RISC复合物中。通常在5’端稳定性较差的那条链被整合为引导链，可能由于其具有较高的AU碱基含量或由于不完整配对。引导链必需与要沉默的mRNA互补，以进行转录后沉默。随后，RISC复合物与复合物中siRNA引导链互补的mRNA结合，mRNA裂解。随后，获得片段被降解。通过这种方式，siRNA引起靶核苷酸序列的转录后沉默，从而避免获得所述序列表达产生的蛋白质。

小麦中的谷物蛋白(7-18％)尽管含量低于碳水化合物(60-75％)，其对于面粉的功能性质也是必需的。主要谷物蛋白为麦谷蛋白和醇溶蛋白，其构成麸质。已发现醇溶蛋白与乳糜泻的发展有关，因为在α和γ醇溶蛋白的区域中已鉴定了由肠T细胞识别的表位(抗原决定簇)(Arentz-Hansen，5 et al.，2002.Gastroenterology 123：03-809)。乳糜泻患者对麸质是不耐受的。麸质不耐受的特征是小肠近端的慢性炎症，其由醇溶蛋白引起。通过生产醇溶蛋白成分显著降低的小麦，可获得适合乳糜泻患者的食物。

已知有4种类型的醇溶蛋白：α、β、γ、ω。近年来使用RNAi技术对小麦醇溶蛋白进行了抑制。迄今为止，只能抑制特定的醇溶蛋白。例如，通过使用遗传构建体产生RNAi类型的发夹可几乎完全消除α型的醇溶蛋白(Folck et al.，2005.XII International Conference on Plant Embryology.Oral presentation)或γ型醇溶蛋白(Gil-Humanes等.2008.Journal of Cereal Science 48(3)：565-568)，所述发夹具有启动子-正义序列-间隔物-反义序列-终止子的结构，但不能有效消除所有类型的醇溶蛋白。

获得具有醇溶蛋白成分显著下降种子的植物具有技术上的困难，例如，首先，编码醇溶蛋白的基因的数目的增加，第二，小麦植物是六倍体。相对于其他基因组拷贝数较低的植物来说，小麦植物中要获得稳定的转化困难更多。

发明详述

本发明涉及包含两条序列对的多核苷酸，每个子序列以特定的顺序合并，产生当转录到RNA時能产生hpRNA(发夹RNA)的序列，例如发夹形状的RNA，能被现有技术中所述的核糖核酸内切酶加工的双链RNA，其被用于产生引起编码所有类型的小麦醇溶蛋白的mRNA(信使RNA)转录后沉默的siRNA。为此，所述四条子序列为：ω醇溶蛋白的有义序列，α、β、γ醇溶蛋白的有义序列，以及两条前反义序列。