[发明专利]鉴别诊断羊痘野毒感染的试剂盒及制备与检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种诊断试剂盒，确切讲是一种用于鉴别诊断羊痘野毒感染的ELISA抗体检测试剂盒，试剂盒中有包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗。

背景技术

羊痘(Capripox)又名羊“天花”，是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。1879年Hansen首次报道了挪威的山羊痘，我国在20世纪40年代先后发现了绵羊痘和山羊痘的流行。羊痘病毒可引起山羊痘(goatpox)、绵羊痘(sheeppox)和牛的结节性疹块病(lumpy skin disease，LSD。本病的主要特征是发热、无毛和少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹、内脏病变(特别是肺)乃至死亡。羊痘是所有动物痘病毒中致病性最为严重的一种，具有高度的传染性，可导致妊娠母羊流产，羔羊死亡，并有非典型症状和继发、并发感染，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类重大传染病，我国将其列为一类动物疾病。羊痘在我国的广泛流行，不仅给我国养羊业及毛皮加工业造成了巨大的经济损失，还严重影响了国际贸易和养羊业的发展。

目前，羊痘的诊断方法较多，但这些方法也都存在很多问题。传统的实验室诊断要借助电子显微镜，但羊痘病毒与传染性脓疱性皮炎病毒在形态上相似，很难区分。琼脂扩散实验(AGID)可用于羊痘病毒的抗原检测，但该抗原与副痘病毒有交叉反应。间接荧光抗体实验(IFAT)存在较深的背景颜色和非特异性反应，同时，此法不能区分羊口疮(orf)、牛脓疱性口炎病毒。病毒中和试验(VNT)是检测羊痘病毒特异性较强的血清学诊断方法，也是目前《国际动物卫生法典》要求的替代诊断试验(目前羊痘尚无指定血清学诊断方法)。然而羊痘感染后主要以细胞免疫为主，动物接触病原后仅产生低水平的中和抗体，所以病毒中和试验敏感性不高。Western印迹试验是以羊痘病毒感染的细胞溶解物检查血清样品中病毒结构蛋白的特异性抗体，具有较好的敏感性和特异性，但该试验价格昂贵，操作繁琐。

酶联免疫吸附试验(ELISA)因其操作方便、快速、敏感、特异性强等优点，现已被广泛应用于许多抗原抗体的检测。1988年Sharm应用山羊痘痂皮制成粗抗原建立了山羊痘抗体的间接ELISA方法，参见Sharm S N，Negi B S.Yadav M P.et al.Application of ELI SA in the detection of goat pox antigen and antibodies.Acta Virologica，1988，32：65-69，但试验的本底值太高，易出现假阳性结果。1997年Rao建立了检测羊痘病毒抗原的免疫捕获ELISA，参见Rao T.V.S.Nandi.Evalution of immunocaputure ELISA for diagnosis of goatpox.Acta Virologica，1997，41：345-348，但该方法单独使用时有一定的限制，需要与对流免疫电泳试验共同应用才能确诊。应用纯化的具有较强抗原性的重组蛋白做抗原进行ELISA可提高其敏感性，1999年Heine利用表达的羊痘病毒P32蛋白为抗原进行ELISA取得成功，参见Heine H G，et al.A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32the homolog of the vaccinia virus H3L gene.Journal ofImmunological Methods，1999，227：187-196，然而P32蛋白制备难度很大，限制了该ELISA方法的应用。因此，筛选能稳定而大量表达的免疫原性强的抗原基因是建立可靠ELISA方法的关键。

羊痘的预防主要依靠疫苗的免疫接种，灭活疫苗具有安全、无毒的特点，但灭活苗的免疫效果较差，弱毒疫苗则具有良好的免疫效果。羊痘病毒的疫苗株与野毒株之间的差异很小，两者氨基酸序列的同源性高达99.9％，因此，接种弱毒疫苗后很难区分疫苗免疫和野毒自然感染。山羊痘弱毒疫苗可同时用于山羊痘和绵羊痘的预防，接种4～5日后即可产生免疫力，抗体持续期可长达12个月，有的羊甚至产生终身免疫。所以，进行羊痘的抗体检测关键在于能否有效的避开弱毒疫苗带来的干扰，目前尚无任何一种能区分出弱毒免疫与野毒感染的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒能特异性检测出羊痘野毒株的抗体，排除弱毒疫苗免疫后的抗体干扰。本发明同时提供这种检测试剂盒的制备与使用方法。