[发明专利]鉴别诊断羊痘野毒感染的试剂盒及制备与检测方法

权利要求书

1.鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体试剂盒，其中有包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗，其特征在于包被的抗原为羊痘病毒ORF95蛋白和ORF 103蛋白的混合物。

2.根据权利要求1所述的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体试剂盒，其特征在于所用的ELISA抗体检测板的规格为8孔×12条的可拆酶标板，所包被的抗原为重组羊痘病毒ORF95蛋白和重组ORF103蛋白的混合物。

3.根据权利要求1或2所述的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体试剂盒，其特征在于其中每孔的抗原包被量为：ORF95蛋白10ng，ORF103蛋白20ng；酶标二抗工作液为兔抗山羊酶标二抗经1×blocking buffer(Sigma)稀释6万倍。

4.权利要求2或3所述的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体试剂盒中所用的重组羊痘病毒ORF95蛋白和重组羊痘病毒ORF103蛋白的制备方法，其特征是以山羊痘病毒弱毒疫苗株基因组DNA为模板，分别以两对特异引物进行PCR扩增，扩增产物经酶切后与pET30a(+)表达载体连接，分别构建原核表达载体pET-95和pET-103，经转化BL21宿主菌表达和纯化后，将阳性重组菌接种于卡那抗性LB培养基中进行诱导表达，分别得到ORF95重组蛋白和ORF103重组蛋白，收集大量表达的重组宿主菌并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用滤膜过滤，经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化得到目的蛋白，所用的两对特异引物分别如下：

ORF95：上游引物：ACCGAATTCATGGACTTCATGAAAAAATATACT；

ORF95：下游引物：ACCAAGCTTTTTGCTGTTATTATCATCCAG；

ORF103：上游引物：ACCGAATTCATGTCTGATAAAAAATTATCTCG；

ORF103：下游引物：ACCAAGCTTATCCATACCATCGTCGATAG。

5.权利要求3所述的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体试剂盒的制备方法，其特征在于用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将纯化的ORF95和ORF103重组蛋白混匀，使得ORF95的终浓度为100ng/mL，ORF103的终浓度为200ng/mL，按100uL/孔加入酶标板中，ORF95重组蛋白每孔的包被量为10ng，ORF103重组蛋白每孔的被量为20ng，4℃包被过夜，用PBST洗板四次，每孔加入200uL 1×blocking buffer 37℃封闭1小时，用PBST洗板四次，室温晾干，装入干燥剂进行真空包装，置4℃保存；酶标二抗工作液为兔抗山羊酶标二抗经1×blocking buffer做6万倍稀释而成；样品稀释液为1×blocking buffer；10倍浓缩洗涤液为含0.5％吐温-20的0.1M、pH7.4磷酸盐缓冲液；底物显色液为四甲基联苯胺；终止液为2M硫酸溶液。

6.根据权利要求3所述的鉴别诊断羊痘野毒感染的ELISA检测试剂盒使用方法，其特征是：

(1)将10×浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；

(2)待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清均用抗体稀释液作1∶100倍稀释，按每孔100uL加入抗体检测板中，37℃孵育30min，甩干；

(3)每孔加入200uL洗涤液，洗涤4次，每次1min，甩干；

(4)每孔加入100uL二抗工作液，37℃孵育30min，甩干；

(5)每孔加入200uL洗涤液，洗涤4次，每次1min，甩干；

(6)每孔加入100uL TMB显色液，37℃避光孵育5min；

(7)每孔加入50uL终止液，用酶标仪在450nm波长下读取光吸收值(OD_450nm值)；

根据测得的OD值确定待检样品是否是野毒感染。