[发明专利]一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学及分子诊断领域的等温核酸扩增技术领域，具体涉及一种减少引物间聚合非特异性扩增的转录等温扩增技术。

背景技术：

基因扩增技术是随着基因工程技术和分子生物学的发展而产生的，1987年，美国PE(Cetus)公司Kary Mullis发明了聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)专利技术(US Patent 4,683,202)。这种通过热循环使模板解链的DNA扩增技术不仅成为生命科学最关键、核心的基础技术。由于其呈几何级数放大的高灵敏度，也开始应用于临床检验等领域，特别是美国ABI公司于1997年推出实时荧光定量PCR(US Patent 6,485,903)技术将传统的检测信号相加的纳克(ng)级检验(部分技术整合级联信号放大可达pg级灵敏度)带进了信号指数放大的飞克(fg)级定量检验，以实时荧光定量PCR技术为代表的基因扩增技术使临床检验从此进入分子诊断及检验分析数字化时代。

与此同时，一系列的不依赖于热循环解链的等温(/恒温)基因扩增技术也有了长足的发展。核酸等温扩增术的特点是扩增反应的全过程(除初始的杂交步骤外)均在单一温度，无需专门的扩增仪器下进行，而不像PCR反应那样，需要经历几十个温度变化的循环过程。等温扩增技术的这一特点，使得它们对所需仪器的要求大大简化，检测时间显著缩短，因而适合于现场快检或床边检测。比较代表性的有：链置换扩增(Strand Displacement Amplification，SDA)，核酸序列依赖扩增(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)，转录介导扩增(Transcription Mediated Amplification，TMA)，滚环扩增(Rolling CircleAmplification，RCA)，连环恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，解旋酶依赖扩增(Helicase Dependent Amplification，HDA)和寡核苷酸恒温扩增(Isothermal Amplificatio of Oligonucleotides)等。其中又以RNA扩增技术灵敏度最高，应用比较成熟。转录介导的扩增方法(即转录RNA扩增技术)包括TMA和NASBA。TMA(PNAS，USA87：p1874和US Patent：5,766,849)是一种利用AMV/M-MLV逆转录酶和T7RNA多聚酶2种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统，主要扩增原理为：目标序列在逆转录酶作用下，以与T7启动子嵌合的引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成末端带T7启动子的双链DNA，并在T7RNA多聚酶作用下，一个DNA分子转录出七百条目标RNA序列，部分RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。NASBA[Nature350(6313)p91和US Patent：7,074,558]的原理与TMA相似，但仅一条引物5’端加上T7启动子序列，进而DNA仅一条链转录；在核酸提取和扩增产物及信号检测方法上也有所不同。转录介导的扩增方法扩增效率极高，灵敏度高于实时荧光定量PCR技术，反应条件简单，无需专门的扩增仪器，且因整个反应在1个试管中恒温进行，减少了热循环PCR产物气雾胶的交叉污染。与RT-PCR比较，该技术可减少样品中抑制性物质的影响，不受背景中DNA的干扰，单链RNA序列是特异的靶序列，产物RNA不易发生交叉污染，降低检测交叉污染的假阳性率。整个反应过程由三种酶控制，操作次数少，并大大缩短检测产生结果的时间。特异性好，忠实性高，其检测效率高于PCR。