[发明专利]一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术

权利要求书

1.“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其特征是借助cDNA步骤的等温扩增大量RNA产物，靶RNA加入带噬菌体启动子序列的引物，以逆转录酶催化生成第一链或两条链均带启动子的cDNA，再以噬菌体RNA聚合酶结合启动子转录大量拷贝RNA产物并循环反应大量扩增的过程，扩增产物通过特异性荧光探针检测。所述的带启动子序列的引物是指选择靶特异性的中间4-8base同序的一对引物，其5’端均加上噬菌体启动子序列，如此高度近似的一对引物存在两段相同序列，最大程度地限制了过量引物间二聚体的非特异性扩增及转录，大大提高了转录介导的恒温扩增技术可靠性。

2.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的扩增模板选择靶基因代表性序列，长100-300bp，其两端选择有4-8base互补且下游取反义链后中间4-8base同序的序列作为引物。

3.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的逆转录酶包括禽类髓母细胞瘤病毒AMV逆转录酶、鼠白血病病毒M-MuLV逆转录酶和RNase H活性失活的重组M-MuLV鼠白血病病毒逆转录酶，另加RNase H酶。

4.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的噬菌体RNA聚合酶包括T₇、T₃、SP₆等RNA聚合酶Polymerase。

5.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的噬菌体启动子序列是指T₇、T₃、SP₆结合识别序列。

6.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的引物设计原则是在引物距3’末端3-5base远的中间部位选取4-8base同序策略，引物3’末端不能有两个以上互补且最末一个碱基绝不能互补，引物5’端不能有三个以上互补特别是连续互补，引物5’端均加上噬菌体启动子序列。

7.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的实验条件同于一般转录介导的等温扩增技术。酶共同反应条件：pH8.5的4mMTris-CL，5mM KCL，1.2mM MgCL，0.2mM DTT和1.5％DMSO，引物浓度3-5μM。

8.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的灯标荧光探针设计原则是：探针环长16-32base，总长最好＜40nt，T_m值比引物的T_m值要高5-10℃；选择的序列接近扩增产物中心，距两引物≥6base；探针锅柄区/发夹区选靶为长4-8bp互补序列以形成锅柄样结构；5’端不能是G碱基，标荧光素，3’端标淬灭剂且必须封闭。

9.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的检测方式包括便携式掌上荧光阅读仪快速即时现场检测；也可以实时荧光等温扩增分析，和通过微纳PCR芯片对多靶基因、多基因位点进行等温扩增-阵列快速检测。

10.根椐权力要求1所述的“一种减少引物二聚体非特异性扩增的转录等温扩增技术”，其所述的技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，dNTPs，rNTPs，T7polymerase，逆转录酶M-MLV及其缓冲液，灯标荧光探针，带T7上游引物F/下游引物R，标准对照物，DEPC纯化水dH₂O，RNasin，矿物油。