[发明专利]一种丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于检测丙型肝炎病毒基因型的检测试剂盒。

背景技术

丙型病毒性肝炎是由多种丙型肝炎病毒(HCV)引起的，以肝脏损害的一组全身性传染病。丙型肝炎主要是通过输血或血制品、血透析、单采血浆还输血球、肾移植、静脉注射毒品、性传播、母婴传播等传染引起的。丙型病毒性肝炎分布较广，容易演变为慢性、肝硬化和肝癌。基因分型在HCV感染、传播、诊断、诊疗、预防等方面均有重要意义。

目前临床上常用的HCV基因分型的检测方法主要有：

1.测序法：采用特异性PCR引物扩增部分病毒基因组区域，联合多部位的测序结果进而描绘系统进化树。直接测序法的优点是可提供被测区域的全部信息，包括病毒基因组内部的多态性，并可以发现新的基因变异形式，缺点是操作繁琐，成本较高，对混合感染不易确定。

2.型特异性RT-PCR方法：通过对套式RT-PCR引物设计的优化，使扩增片断大小不同，达到分型目的。改良后的方法可将6个基因型完全分开，并可以区分混合感染。该方法的优点是成本较低，不需要特殊设备，缺点是有时会出现较弱的扩增条带，难以判断。

3.型特异性探针杂交法：通过将生物素或荧光素标记型特异性探针固相化在膜或芯片上，与RT-PCR扩增的病毒产物进行杂交后，经扫描判读出HCV基因型，代表性试剂为Inno-LiPA II。该方法准确性和灵敏性较高，在国外报道的HCV基因分型研究中常用。

4.基因芯片法：近来开发的新方法，与测序法的符合率在90％以上，适用于大量样本的检测，需要专用检测分析设备。

发明内容

本发明的目的在于：针对上述现有HCV基因分型检测存在的问题，利用PCR-荧光探针法，使丙型病毒性肝炎的基因分型有更为科学、便捷的检测诊断手段，可为医院、病人普遍接受。

为了达到上述发明目的，本发明的技术方案为：提供一种丙型肝炎病毒基因分型检测方法及试剂盒，采用一步荧光RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行检测。在核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短。本发明方法操作简便、敏感度高、结果明晰。

本发明提供的试剂盒包括：RT-PCR反应液、RT-PCR混合酶、引物探针、阴性对照、HCV 1型阳性对照、HCV 2型阳性对照。其中所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl(pH8.3)20mM、KCl 100mM、明胶0.2mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.4mM、MgCl₂6mM的混合液；所述的RT-PCR混合酶为逆转录酶和Taq酶的混合物；所述的引物探针为HCV特异性引物、HCV 1型特异性探针及HCV 2型特异性探针的混合液；所述的阴性对照为无HCV RNA的人血清；所述的HCV 1型阳性对照为含有HCV 1型基因片段的非传染性体外转录RNA的人血清；所述的HCV 2型阳性对照为含有HCV 2型基因片段的非传染性体外转录RNA的人血清。

检测用的HCV片段特异性引物分上游引物和下游引物，

上游引物序列<SEQ ID No.3>为：5’-TGAGTACACCGGAATTGCC-3’

下游引物序列<SEQ ID No.4>为：5’-CTACTCGGCTAGCAGTCT-3’

HCV 1型特异性探针序列<SEQ ID No.5>为：

5’-CAACCCGCTCAATGCCTGGAG-3’。

HCV 2型特异性探针序列<SEQ ID No.6>为：

5’-AAACCCACTCTRTGCCCGGTC-3’

本发明提供的试剂保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立HCV 1型阳性对照、HCV 2型阳性对照和阴性对照。

扩增检测：

a、按反应样本数(反应样本数＝待检样品数+对照品3个+1)n配制反应液：取RT-PCR反应液n×12.5μl、引物探针n×2μl、RT-PCR混合酶n×0.5μl于一离心管中混匀；低速离心数秒，按15μl/管分装到反应管中。

b、取样本提取物、阴性对照提取物、HCV 1型阳性对照提取物和HCV 2型阳性对照各10μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置全自动荧光PCR仪上。