[发明专利]一种丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：本发明通过考察人体丙型肝炎病毒各个亚型序列之间特异位点的差异，设计出一对HCV特异性引物、一条HCV 1型特异性荧光探针和一条HCV 2型特异性荧光探针，采用实时PCR方法扩增目的基因。

2.一种丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：本发明采用一步RT-PCR技术对丙型肝炎病毒进行基因分型检测。在核酸提取后，直接配制反应体系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短。该方法操作简便、敏感度高、结果明晰，非常适合血清或血浆中丙型肝炎病毒的基因分型检测。

3.如权利要求2中所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR反应液的配制和扩增程序如下：

a、一步基因分型RT-PCR反应液的配制：

将RT-PCR反应液、RT-PCR混合酶(Taq酶1.5U/ul，逆转录酶0.5U/ul)、引物探针按照12.5∶0.5∶2的比例混合，反应液体积为15ul。

b、一步基因分型RT-PCR反应程序：

[1]50℃                15min

[2]95℃                2min

[3]94℃                10s

[4]60℃                45s

[5]Go to[3]，45cycles

在第四步采集荧光。

[6]End

4.如权利要求1所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括以下成分：RT-PCR反应液、RT-PCR混合酶、引物探针、阴性对照、HCV 1型阳性对照、HCV 2型阳性对照。

5.如权利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR反应液为Tris-HCl(pH8.3)20mM、KCl 100mM、明胶0.2mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dTTP各0.4mM、MgCl₂6mM的混合液；所述的RT-PCR混合酶为逆转录酶和Taq酶的混合物；所述的引物探针为一对HCV特异性引物、HCV 1型特异性探针及HCV 2型特异性探针的混合液；所述的阴性对照为无HCV RNA的人血清；所述的1型阳性对照为含有HCV 1型基因片段的非传染性体外转录RNA的人血清；所述的2型阳性对照为含有HCV 2型基因片段的非传染性体外转录RNA的人血清。

6.如权利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：丙型肝炎病毒特异性PCR扩增的基因序列为<SEQ ID No.1>：5’

-TGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTG

GTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTT

TCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAG

ACTGCTAGCCGAGTAG-3’(HCV 1型)

和<SEQ ID No.2>：

5’

-TGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTG

GTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTT

TCTTGGATAAACCCACTCTRTGCCCGGTCATTTGGGCGTGCCCCCGCGAG

ACTGCTAGCCGAGTAG-3’(HCV 2型)。

丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒扩增序列全长165bp，属5’非编码区，为单拷贝序列。

7.如权利要求4所述的丙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒，一对HCV特异性引物序列中一条序列与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的部分序列相同，另一条序列与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中所示的部分序列互补；HCV 1型特异性探针与SEQ ID No.1中所示的部分序列相同或互补；HCV 2型特异性探针与SEQ ID No.2中所示的部分序列相同或互补。