[发明专利]一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法。

背景技术

Exendin-4，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，是从一种巨蜥唾液中提取的由39个氨基酸残基组成的生物活性多肽，与GLP-1具有一系列相同的抗糖尿病作用，其氨基酸序列如下所示：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser

Exendin-4能够刺激胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌，其调节作用具有血糖浓度依赖性。Exendin-4在生物体内具有更长的生物学半衰期和更强的生物学活性，因此是治疗2型糖尿病的理想药物。目前获得Exendin-4的方法主要为化学合成法和基因工程重组法。2005年4月，化学合成的肠降血糖素类似物Exenatide(酰胺化的Exendin-4)经美国FDA批准上市，主要用于改善二甲双胍和磺酰脲类药物治疗不理想的2型糖尿病患者的血糖控制。

目前，生物样品常用的分析方法包括色谱法和免疫法。色谱法灵敏度较低，不能达到临床和非临床试验要求；而且色谱法需要将血样进行预处理(如过C18色谱柱)，试验过程繁琐，回收率不稳定。

免疫法是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法，是当前临床和非临床生物样品检测方法中最为常用的一种，多用于蛋白质多肽类物质的检测。免疫法依据不同的标记物可分为放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)等。

放射免疫分析法(RIA)是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法，由于敏感度高、特异性强、精密度高、并可测定小分子量和大分子量物质，所以在检验医学中应用极为广泛，常用于测定各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物等。但由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员须经过特殊训练。另外，由于核素有半衰期，有效期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。

酶免疫分析法(EIA)是将酶的高效催化作用和抗原抗体反应的高度特异性相结合，发展建立起来的一种免疫性标记分析方法。酶的催化作用可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。酶免疫分析法试剂制备容易掌握，半衰期长，实验操作简便，试剂对环境污染小，并且测定的特异性和灵敏度高，因此已广泛应用于临床和非临床检测。

酶免疫分析法的底物分为普通显色底物、荧光底物等。目前，普通显色底物应用广泛，但灵敏度较低，达不到临床和非临床试验要求。荧光底物具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，因此越来越多的应用于分析检测方法中。荧光底物在吸收特定波长的光能后，发生原子重排，同时发射出更长波长的荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，在荧光酶标仪下可以检测到。荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通分析法中杂色光的影响，从而提高了光学分析的灵敏度。现在常用的过氧化物酶的荧光底物包括：对羟基乙酸(HPA)，3-对羟基苯丙酸(HPPA)，高香草酸(HAV)，佳味醇(CV)等。

用于检测蛋白多肽类抗原的酶免疫分析法主要是双抗体夹心法和竞争法。蛋白大分子抗原测定多用双抗体夹心法，而对只有单个抗原表位的小分子激素、药物等，因其可能只有一个抗原表位，或因为分子太小，结合一个抗体后，因空间位阻，无法再结合另一个抗体，所以不适合使用双抗体夹心方法测定。由于Exendin-4为含有39个氨基酸残基的小分子多肽，很难找到两个独立的抗原决定簇，不适合使用双抗体夹心方法测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可应用于临床和非临床样品定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法，本发明所述方法条件优化，灵敏度高，特异性强。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种定量检测Exendin-4的酶免疫分析方法，包括以下步骤：

步骤1：用第二抗体包被酶标板，洗板，BSA封闭，洗板；

步骤2：加抗Exendin-4第一抗体孵育，洗板；

步骤3：加Exendin-4标准品及样品，并设立对照，加生物素标记Exendin-4孵育，洗板；

步骤4：加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育，洗板；