[发明专利]一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程，具体的说是一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药及其制备方法和应用。

背景技术

利用高等植物反应器表达功能蛋白进而开发渔药，具有极大创新和实际意义。与原核生物相比，发酵罐需要电能，而植物直接利用太阳能；植物细胞具有完整的真核细胞表达系统，能对表达的外源蛋白进行翻译后加工，使表达产物具有生物活性；如果选择可直接食用的植物生产功能性产品，还可省去费用昂贵的纯化过程；与转基因动物相比，植物可以大田栽培，产量高，繁殖成本低，更适合规模化生产；植物本身不含有潜在的导致人类疾病的微生物，对人类十分安全；转基因植物也可有效避免动物生物反应器可能存在的伦理学问题。对于生产具有强烈抗菌抑菌活性的抗菌肽类物质，使用植物生物反应器可以避免产物本身对原核和真核工程菌的裂解，从而无需增加保护性基团即可直接表达，保证了产物活性，减少了工艺步骤，降低了生产成本，从而表现出独特优势。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药：以中国明对虾血细胞总RNA的反转录产物为模板，采用引物PF1和PR1进行PCR扩增，SEQID No.1所示的扩增产物经修饰后转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗种植后的米糠即为渔药。

将转入水稻中的SEQ ID No.1所示的扩增产物按如下步骤修饰后再转入水稻中；

1)通过T4连接酶将SEQ ID No.1所示的扩增产物连接入pMD 18-T载体上待用；

2)用SalI和XbaI分别双酶切携带penaeidin(SEQ ID No.1)的上述T-载体和pBluscript空载体，得到连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段和线性化的pBluscript空载体，待用；

3)通过T4连接酶将步骤2)连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段连接入到用SalI和XbaI分别双酶切的pBluscript空载体中，在连接后pBluscript-penaeidin质粒中SEQ ID No.1上游引入KpnI酶切位点，待用；

4)用KpnI和XbaI分别酶切上述步骤3)引入酶切位点的pBluscript-penaeidin质粒和已经连接有35S启动子和终止子的植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段和线性化的pCAMBIA1305.2空载体，待用；

5)通过T 4连接酶将步骤4)酶切后携带SEQ ID No.1的片段连接到步骤4)酶切后植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到植物表达载体pCAMBIA1305-penaeidin5-3。

所述引物PF1和PR1分别为：PF1：agcctcacctgcagagaccg PR1：tgcacttacatcccacat。

利用水稻作为生物反应器的蛋白渔药的制备方法：以中国明对虾血细胞总RNA的反转录产物为模板，采用引物PF1和PR1进行PCR扩增，SEQ ID No.1所示的扩增产物经修饰后通过农杆菌介导法转入水稻中，携带扩增产物的转基因再生苗的米糠即为渔药；所述引物PF1和PR1分别为：PF1：agcctcacctgcagagaccg PR1：tgcacttacatcccacat。

将转入水稻中的SEQ ID No.1所示的扩增产物按如下步骤修饰后再转入水稻中；

1)通过T4连接酶将SEQ ID No.1所示的扩增产物连接入pMD 18-T载体上待用；

2)用SalI和XbaI分别双酶切携带penaeidin的上述T-载体和pBluscript空载体，得到连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段和线性化的pBluscript空载体，待用；

3)通过T4连接酶将步骤2)连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段连接入到用SalI和XbaI分别双酶切的pBluscript空载体中，在连接后pBluscript-penaeidin质粒中SEQ ID No.1上游引入KpnI酶切位点，待用；

4)用KpnI和XbaI分别酶切上述步骤3)引入酶切位点的pBluscript-penaeidin质粒和已经连接有35S启动子和终止子的植物表达载体pCAMBIA1305.2，得到连接有SEQ ID No.1所示的酶切片段和线性化的pCAMBIA1305.2空载体，待用；