[发明专利]哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法、应用以及表达该抗原的菌株

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法和该抗原作为抗海水鱼类弧菌病疫苗的应用，以及表达该抗原的菌株。

背景技术

弧菌为革兰氏阴性杆菌或弯曲杆菌，广泛分布于海洋、河口等各种盐度的水生环境，也可见于人或鱼肠道中。弧菌是最主要的海水养殖动物的病原菌，由病原弧菌引起的感染性疾病在世界各地普遍流行。我国沿海各省海水养殖业发达，但主要养殖品种如大黄鱼、鲈鱼、石斑鱼、牙鲆、大菱鲆、欧洲鳗等均受到弧菌病的严重危害。传统的抗生素治疗在防治海水动物弧菌病中曾经发挥了重要的作用，但是由于长期用药可能引起水产品药物残留和耐药菌的传播问题，目前农业部对抗生素在水产养殖中的使用已有严格的规定，能够应用的种类少之又少。近年来，免疫预防由于其对动物无副作用、对环境的友好特性、预防特定疾病的有效性而备受重视，疫苗在水产动物病害控制中的应用正逐步推广。目前在养殖实践中应用的多数为灭活疫苗，一般以浸泡的方式进行免疫接种，存在相对保护率较低、有效保护期不长等不足。研究者们努力开展基因工程疫苗研究，应用大肠杆菌表达的亚单位疫苗成分进行注射或口服免疫，但是，由于原核表达的重组蛋白多数以不溶的包涵体形式表达，抗原蛋白需经历后期相对难度较大的纯化和复性过程，批量生产工艺复杂，生产成本居高不下，难以大规模推广应用。弧菌外膜蛋白ompK作为弧菌属种类中一种较为保守的功能性外膜蛋白，其良好的免疫原性已经获得验证(Fish & ShellfishImmunology，23(2007)567-575)。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种表达哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的菌株。

本发明的目的之二在于提供一种可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原。

本发明的目的之三在于提供一种哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法。

本发明的目的之四在于提供一种用于防治海水鱼类弧菌病的口服疫苗。

本发明的目的之五在于提供哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原在抗海水鱼类弧菌病疫苗方面的应用。

本发明可表达哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白ompK抗原的菌株，其为一种毕赤酵母重组菌株(Pichiapastoris)GS115-ompK，它的保藏编号为CGMCC No.4362，其具有分泌表达如序列<400>2的氨基酸序列的可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的能力。

本发明哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的DNA，它的核苷酸序列如序列<400>1所述。

本发明哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原，它的氨基酸序列如序列<400>2所述。

本发明哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法，是以哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株(Vibrio harveyi)zj2008的基因组DNA为模板，用PCR方法克隆ompK的编码基因，将该基因重组到表达质粒pPIC9K中，获得重组质粒pPIC9K-ompK，将重组质粒线性化，以原生质体转化的方法整合到毕赤酵母GS115细胞中，获得整合了质粒pPIC9K-ompK DNA的毕赤酵母重组菌株，该毕赤酵母重组菌株GS115-ompK的保藏编号为CGMCC No.4362，转化的毕赤酵母GS115重组菌株细胞在甲醇诱导下表达重组蛋白，重组蛋白以可溶性的形式分泌到培养液中，表达的蛋白经离心后收集，浓缩；所述哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株zj2008的保藏编号为CGMCC No.4363。

本发明防治海水鱼类弧菌病的口服疫苗，其由如序列<400>2的氨基酸序列的可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原佐以药学上可接受的佐剂而成。所述佐剂为海藻酸钠和壳聚糖。所述哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原在疫苗中的含量为10mg/L，海藻酸钠和壳聚糖在疫苗中的含量分别为1.5wt％和1.0wt％，其为一种微球疫苗悬液。使用时，该微球疫苗悬液可拌于海水鱼饲料中给海水鱼口服，并且以添加适量玉米油为宜，优选是，微球疫苗悬液、海水鱼饲料及玉米油的重量配比优选为10∶90∶3。

本发明如序列<400>2的氨基酸序列的哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原，可制备弧菌基因工程口服亚单位疫苗，用于防治海水鱼类弧菌病。