[发明专利]哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法、应用以及表达该抗原的菌株

权利要求书

1.一种毕赤酵母重组菌株(Pichiapastoris)GS115-ompK，它的保藏编号为CGMCCNo.4362，其具有分泌表达如序列<400>2的氨基酸序列的可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的能力。

2.一种哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的DNA，它的核苷酸序列如序列<400>1所述。

3.一种哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原，它的氨基酸序列如序列<400>2所述。

4.一种如权利要求3所述的哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原的制备方法，是以哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株(Vibrio harveyi)zj2008的基因组DNA为模板，用PCR方法克隆ompK的编码基因，将该基因重组到表达质粒pPIC9K中，获得重组质粒pPIC9K-ompK，将重组质粒线性化，以原生质体转化的方法整合到毕赤酵母GS115细胞中，获得整合了质粒pPIC9K-ompK DNA的毕赤酵母重组菌株，该毕赤酵母重组菌株GS115-ompK的保藏编号为CGMCC No.4362，转化的毕赤酵母GS115重组菌株细胞在甲醇诱导下表达重组蛋白，重组蛋白以可溶性的形式分泌到培养液中，表达的蛋白经离心后收集，浓缩；所述哈维氏弧菌鲈鱼分离致病株zj2008的保藏编号为CGMCCNo.4363。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述PCR方法中所用引物为：

引物p1：5′GGAATTCGCTGACTACTCAGACGGCG 3’；

引物p2：5’ATAAGAATGCGGCCGCTTAGAACTTGTAAGTTACTGC 3’；

并在引物p1和引物p2的5’端分别引入酶切位点EcoR I和Not I。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于所述PCR方法中的PCR反应条件为：初始变性94℃，4min，94℃变性，45S，56℃，45S，72℃，60S，循环30次，最后72℃延伸5min。

7.一种防治海水鱼类弧菌病的口服疫苗，其特征在于其由如序列<400>2的氨基酸序列的可溶性哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原佐以药学上可接受的佐剂而成。

8.根据权利要求7所述的口服疫苗，其特征在于所述佐剂为海藻酸钠和壳聚糖。

9.根据权利要求8所述的口服疫苗，其特征在于所述哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原在疫苗中的含量为10mg/L，海藻酸钠和壳聚糖在疫苗中的含量分别为1.5wt％和1.0wt％。

10.一种如序列<400>2的氨基酸序列的哈维氏弧菌外膜蛋白ompK抗原在制备防治海水鱼类弧菌病口服疫苗方面的应用。