[发明专利]一种分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种过氧化物酶的制备技术，具体涉及提取番薯中过氧化物酶的方法。

(二)背景技术

过氧化物酶(Peroxidase，POD)在自然界中分布广泛，资源丰富，是临床检测和诊断的常用标记酶。过氧化物酶与各种抗体的标记物，结合酶联免疫分析技术(Enzyme-linked immunosorbent asssay，ELISA)作为常规手段可用于多种疾病的定位、定量检测，操作简便。

辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HR)是迄今为止在酶联免疫分析中应用最广泛的标记用酶，但是作为原料需要专门种植辣根，辣根作为非种植植物，原料来源受到限制，相对成本投资提高。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一个从番薯皮中提取过氧化物酶的方法，更好地解决材料来源的问题和成本问题并可以获得高纯度高活性的过氧化物酶。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，包括如下步骤：

(1)番薯清洁后取皮，加入pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲液，0-15℃均浆抽提，抽提后过滤，得滤液；

(2)取滤液边搅拌边加入双水相萃取剂固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为20-30％，PEG6000的质量百分比浓度为6-8％，充分搅拌溶解后，0-15℃静置分层，取下层溶液即为粗酶液；冷冻干燥后可得到过氧化物酶粗品。

(3)由步骤(2)得到的粗酶液直接经Phenyl Sepharose6fast flow疏水层析，上样后用0-1mol/L的硫酸铵水溶液梯度洗脱，收集呈酶活性的洗脱液后冻干；

(4)步骤(3)所得冻干粉通过下列a或者b的方法处理，得到过氧化物酶制品；

a.冻干粉溶于生理盐水，经Sepharose CL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶解于pH 7.1-8.5的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品；

b.冻干粉溶解于pH 7.1-8.5的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶于生理盐水，经SepharoseCL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品。

本发明所述步骤(1)中，pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲液的体积用量以番薯皮的质量计为5-10mL/g。优选磷酸盐缓冲液的pH为8.0。

本发明步骤(1)过滤所得滤液，优选进一步进行离心处理，以去除淀粉和小颗粒组织颗粒，取离心上清液进行步骤(2)的处理。所述离心处理优选在0-15℃进行。

本发明所述步骤(2)中，优选加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为30％，PEG6000的质量百分比浓度为8％。

本发明所述步骤(3)中，优选上样后依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸铵水溶液分步洗脱。

本发明所述步骤(4)中，所述离子层析中，优选控制Tris-HCl缓冲液的pH为8.3。

进一步，本发明具体推荐所述的方法按照如下步骤进行：

(1)取番薯，清洗，收集番薯皮，先加pH 8.0磷酸盐缓冲液绞碎，绞碎过程中保持温度在4℃，然后搅拌均匀后，于4℃浸提，充分浸提后过滤收集滤液，残渣重复提取，合并滤液；滤液于4℃离心去除淀粉和小颗粒组织颗粒，收集上清液；所述pH 8.0的磷酸盐缓冲液的体积用量以番薯皮的质量计为5-10mL/g；

(2)取步骤(1)所得上清液，边搅拌边加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为30％，PEG6000的质量百分比浓度为8％，1h内加完，然后静置，静置过程中保持温度在4℃，静置分层后取下层溶液，即为粗酶液；

(3)粗酶液经Phenyl Sepharose6fast flow疏水层析，依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸铵水溶液分步洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；

(4)步骤(3)所得冻干粉通过下列a或者b的方法处理，得到过氧化物酶制品；