[发明专利]一种分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法

权利要求书

1.一种分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，包括如下步骤：

(1)番薯清洁后取皮，加入pH 7.0-8.0磷酸盐缓冲液，0-15℃均浆抽提，抽提后过滤，得滤液；

(2)取滤液边搅拌边加入双水相萃取剂固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为20-30％，PEG6000的质量百分比浓度为6-8％，充分搅拌溶解后，0-15℃静置分层，取下层溶液即为粗酶液；

(3)由步骤(2)得到的粗酶液直接经Phenyl Sepharose6fast flow疏水层析，上样后用0-1mol/L的硫酸铵水溶液梯度洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；

(4)步骤(3)所得冻干粉通过下列a或者b的方法处理，得到过氧化物酶制品；

a.冻干粉溶于生理盐水，经Sepharose CL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶解于pH 7.1-8.5的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品；

b.冻干粉溶解于pH 7.1-8.5的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶于生理盐水，经SepharoseCL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品。

2.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中，pH 7.0-8.0的磷酸盐缓冲液的体积用量以番薯皮的质量计为5-10∶1。

3.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中，使用的磷酸盐缓冲液的pH为8.0。

4.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所得滤液进行离心处理，取离心上清液进行步骤(2)的处理，所述离心处理在0-15℃进行。

5.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中，加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为30％，PEG6000的质量百分比浓度为8％。

6.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(3)中，上样后依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸铵水溶液分步洗脱。

7.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述步骤(4)中，所述离子层析中使用的Tris-HCl缓冲液的pH为8.3。

8.如权利要求1所述的分离提取番薯皮中过氧化物酶的方法，其特征在于所述的方法具体按照如下步骤进行：

(1)取番薯，清洗，收集番薯皮，先加pH 8.0磷酸盐缓冲液绞碎，绞碎过程中保持温度在4℃，然后搅拌均匀后，于4℃浸提，充分浸提后过滤收集滤液，残渣重复提取，合并滤液；滤液于4℃离心去除淀粉和小颗粒组织颗粒，收集上清液；所述pH 8.0的磷酸盐缓冲液的体积用量以番薯皮的质量计为5-10mL/g；

(2)取步骤(1)所得上清液，边搅拌边加入固体硫酸铵和PEG6000，使硫酸铵的质量百分比浓度为30％，PEG6000的质量百分比浓度为8％，1h内加完，然后静置，静置过程中保持温度在4℃，静置分层后取下层溶液，即为粗酶液；

(3)粗酶液经Phenyl Sepharose6fast flow疏水层析，依次用1.0mol/L、0.5mol/L、0mol/L的硫酸铵分步洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；

(4)步骤(3)所得冻干粉通过下列a或者b的方法处理，得到过氧化物酶制品；

a.冻干粉溶于生理盐水，经Sepharose CL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶解于pH 8.3的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品；

b.冻干粉溶解于pH 8.3的Tris-HCl缓冲液中，对Tris-HCl缓冲液透析，透析液上样，经ToYoPEAPL DEAE-650M离子层析，用0-1mol/L氯化钠水溶液线性洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，冻干；冻干粉溶于生理盐水，经SepharoseCL-6B凝胶层析，用生理盐水洗脱，收集呈酶活性的洗脱液，透析，冻干，即为过氧化物酶制品。