[发明专利]GeXP多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种GeXP(GenomeLab eXpress Profiling)多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法与应用。

背景技术

随着转基因作物品种日益增多和全球种植面积不断扩大，转基因食品已成为全球食品消费市场的重要组成部分。转基因食品的安全性尤其是食用安全性，也日益引起人们的关切。随着国际贸易和转基因技术的发展，欧盟和美国、日本等国家先后出台了相应的法律和管理方法，对转基因食品实行强制标识或自愿标识。我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。可以看到，对转基因食品的检测已经成为必然的世界趋势。因此我们必须加强对转基因食品检测技术的深入研究。一些外源基因常作为转基因作物的筛选检测基因，如5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)，来源于杆菌草丁膦乙酰转移酶基因(BAR)，草丁膦乙酰转移酶基因(PAT)，玄参花叶病毒35S启动子(FMV35S)，花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)。

目前，国内外对转基因农作物检测技术种类较多，大体分为两种：一是检测是否含有外源的蛋白质，即外源基因的表达产物，主要采用ELISA法；二是检测是否含有外源基因(DNA)，主要有基因芯片法和PCR检测法，其中PCR技术较为成熟，具有快速、简便、灵敏等特点。目前，国内外许多科研单位及相关机构将单重PCR技术应用于转基因作物检测。单重PCR技术的主要局限性在于通量不高，这是由于单基因PCR每次只能检测一个基因或转基因元件，如果要同时检测转基因植物中的外源基因、转基因元件或鉴定外源基因、转基因元件的种类等，需要做多个单PCR，而且需要知道待检片段的序列信息，不仅操作繁琐，费时且成本较高，而且在实际应用中转基因元件种类多，序列不确定，难以逐一检测和鉴定。多重PCR在一定程度上解决了上述问题，可以一次检测和鉴定多个外源基因或转基因元件，提高了检测效率。但多重PCR方法本身还存在一些普遍的问题，如特异性和灵敏度不高；由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物二聚体的概率大大增加，反应动力性也极其复杂；扩增中某几个特定片段优先扩增，其他片段不能扩增出；同时检测的目的基因数量一般小于10个等(多在3-5个基因)，使得多重PCR还达不到高通量快速检测和分析的目标。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种GeXP多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法。该方法能同时检测转植物中的多种转基因成分。

本发明的另一目的在于提供所述GeXP多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种GeXP多重PCR技术检测植物中转基因成分的方法，包括以下步骤：

(1)设计外源基因和内源基因的引物，下述引物均为5’-3’；

外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的上下游引物分别为：

EPSPS-F：AGGTGACACTATAGAATAGTTGCGGCCCTGCTTGTT

EPSPS-R：GTACGACTCACTATAGGGAGGCGGTCGCTTTCCTTGA；

外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)的上下游引物分别为：

CaMV35s-F：AGGTGACACTATAGAATAGCTCCTACAAATGCCATCA

CaMV35s-R：GTACGACTCACTATAGGGAGATAGTGGGATTGTGCGTCA；

外源基因胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)的上下游引物分别为：

NOS-F：AGGTGACACTATAGAATAATCGTTCAAACATTTGGCA

NOS-R：GTACGACTCACTATAGGGAATTGCGGGACTCTAATCATA；

外源基因草丁膦乙酰转移酶基因(BAR)(来源于杆菌Bacillus amyloliquefaciens)的上下游引物分别为：

Bar-F：AGGTGACACTATAGAATATCTGCACCATCGTCAACCACT

Bar-R：GTACGACTCACTATAGGGACTCCAGGGACTTCAGCAGGTG；

外源基因草丁膦乙酰转移酶基因(PAT)的上下游引物分别为：