[发明专利]血液1,5-脱水葡萄糖醇的检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生化技术以及生物化学检验技术，特别是用于体外定量测定血液中1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)含量的检测方法及试剂盒。

背景技术

糖尿病属于临床常见病、多发病，原因是胰岛素分泌不足引起，血液中1，5-脱水山梨醇(1，5-AG)与葡萄糖(GLU)、糖化血红蛋白(HbAlc)、果糖胺(FMN)呈显著的负相关。有资料表明，血浆葡萄糖(GLU)＞8.3mmol/L者，无一例伴有高水平的血浆1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)。

1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)可以作为糖尿病患者早期诊断的灵敏性特异性指标，亦可作为糖尿病治疗与愈后观察的评价指标。现行的糖尿病诊断指标有明显的不足，空腹血糖测定不灵敏，其决定水平难以定论，尤其对于II型糖尿病病人漏诊率较高；口服糖耐量实验虽可动态监测血糖变化，但操作繁琐，对于已确诊患者在治疗、愈后的观察中使用危险性较大，且易诱发高血糖危象；糖化血红蛋白(HbAlc)虽然是一种早期诊断指标，但属于半定量分析，不能满足临床要求。

1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)与现有的糖尿病指标均呈现出显著的负相关，血液中1，5-脱水葡萄糖醇的减少程度与糖尿病的严重程度显著相关。1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)与其他指标最显著的区别是反映糖尿病病情变化的周期不同，血糖(GLU)反映病人当时血糖状况，果糖胺(FMN)反应病人半个月内血糖的平均状况，糖化血红蛋白(HbAlc)反映病人最近3个月左右的血糖平均水平，而1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)可以反映近几天至1周的平均血糖水平。

目前国内外主要采用全酶法测定1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)，主要有氧化酶法与脱氢酶法两种方法。这两种方法都需要一系列的酶参与消除葡萄糖干扰与生成有色物质进行检测。目前主要缺点是原料来 源困难，黄递酶(DI)、1，5-脱水葡萄糖醇脱氢酶(1，5-AG-HK)与吡喃糖氧化酶(PROD)(氧化酶方法)价格均较高，且来源困难。目前市场上大多为干粉试剂(现有试剂稳定性较差)，检测容易受到内源性物质如葡萄糖、胆红素、抗坏血酸、血脂等干扰，特异性有待进一步提高。

发明内容

本发明提供一种新的测定血液中1，5-脱水葡萄糖醇的方法，在该方法中，通过吡喃糖氧化酶(PROD)催化1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)生成1，5-脱水果糖和H₂O₂；4-氨基安替比啉(4-AAP)、3-羟基-2，4，6-三羟基苯甲酸(HTIB)和H₂O₂在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用下生成醌类化合物(红色)；利用比色分析原理可以得出血液中1，5-脱水葡萄糖醇(1，5-AG)水平。

因此，本发明一方面涉及一种测定血液1，5-脱水葡萄糖醇含量的方法，所述方法通过下述反应测定血液1，5-脱水葡萄糖醇含量：

其中，利用葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶清除血液中的葡萄糖，随后利用吡喃糖氧化酶催化1，5-脱水葡萄糖醇产生过氧化氢，色原与过氧化氢在辣根过氧化物酶的催化作用下产生有色底物，进行比色分析由此确定血液1，5-脱水葡萄糖醇的含量。

发明人发现在使用本发明的方法测定血液1，5-脱水葡萄糖醇含量时，可进一步选择下述步骤中的一种或几种的组合：可加入亚铁氰化钾与表面活性剂的组合消除样本中高胆红素对样本测值的影响；还可通过加入表面活性剂消除样本中甘油三酯对样本测值的影响；也可通 过加入抗坏血酸氧化酶消除样本中高抗坏血酸对样本的影响。

本发明另一方面提供一种测定血液1，5-脱水葡萄糖醇含量的试剂盒，包括试剂I和试剂II两部分，其中试剂I含有葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸氧化酶、表面活性剂、亚铁氰化钾、缓冲液、防腐剂、稳定剂；试剂II含有吡喃糖氧化酶、4-氨基安替比啉、辣根过氧化物酶、3-羟基-2，4，6-三羟基苯甲酸、缓冲液、防腐剂、稳定剂。

本发明提供的试剂盒中，每升试剂I溶液中各组分的含量可以是：

葡萄糖氧化酶(GOD)        1-50KU

过氧化氢酶(CAT)          1-20KU

抗坏血酸氧化酶(ASO)      1-20KU

表面活性剂               0.01-10％

亚铁氰化钾               0.1-10000umol

磷酸盐缓冲液(PBS)        1-500mmol