[发明专利]一种重组腺病毒及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组腺病毒，尤其是一种能在同一腺病毒中分别表达猪瘟病毒E2基因和蓝耳病病毒GP5基因的重组腺病毒及其构建方法，属于生物技术领域。

背景技术

猪瘟是危害养猪业的主要传染病之一。目前，免疫接种仍是猪瘟防治的主要措施，而且是根除本病和阻止野毒传向无猪瘟猪群传播的必要手段。猪瘟疫苗无论在过去、现在还是将来，对控制和消灭猪瘟都具有极其重要的作用，各国学者对猪瘟疫苗的研制和开发一直没有放弃。传统的猪瘟疫苗包括灭活疫苗和弱毒疫苗，但灭活苗免疫效力低，保护期短，激发机体产生免疫力的速度慢，且到目前为止，组织培养猪瘟毒的产量和灭活所造成的病毒有效抗原的损失仍是制造灭活疫苗的二大障碍。猪瘟弱毒疫苗的广泛应用，对于控制猪瘟的流行起到了关键作用。但是弱毒疫苗也有其不足的地方，首先近年来猪瘟的流行特点在世界范围内发生了很大的变化，呈现周期性、波浪形的的地区性散发和温和性猪瘟，发病后的临床症状是：无名高热、症状不典型、持续性感染、出生仔猪先天性震颤和母猪繁殖性障碍。用传统疫苗免疫常常造成免疫失败，即使将剂量增加到750个兔体反应(国家规定150个兔体反应)也不能预防其感染，而且有蔓延的趋势。在妊娠早期接种疫苗还会发生疫苗毒通过胎盘感染胎儿，造成死胎或弱仔并成持续性带毒者，产生新的疫源；其次，弱毒疫苗已经沿用了近40年，猪瘟的流行形式发生了很大变化，说明猪瘟病毒的抗原性可能存在着变异，特别是近年来国内外应用单克隆抗体对C-株检测，发现有不同的反应模式，表明经过多年在不同细胞上的驯化，C-株已经产生变异，这种流行毒株的变化趋势国内外情况基本一致，流行毒往往逃避免疫，导致免疫失败的严重后果。第三，接种弱毒疫苗还会影响到国际贸易，欧盟已禁止使用猪瘟弱毒疫苗，而采用严格的卫生防疫制度、扑杀猪瘟感染猪和血清学阳性猪来控制和消灭猪瘟。采用扑杀政策需要大量的人力、物力和巨额资金，发展中国家是难以承受的，这就促使人们研究和开发新型的猪瘟疫苗来防控本病。近年来，基因工程技术的迅猛发展，为新型猪瘟疫苗的研究和开发提供了工具，目前，猪瘟基因工程疫苗的研制已经成为新的研究方向和热点。

蓝耳病在我国大面积流行近10年了，其灭活疫苗从最初的普通疫苗发展到今天的高效浓缩疫苗，其免疫次数也越来越多，在实际应用中，灭活苗的免疫原性较差，往往接种后抗体效价较低，达不到保护的作用，而且灭活苗注射剂量大、免疫次数多、抗体产生慢。如果抗体与野毒的基因序列比较相似，同样会产生保护；如果基因序列不相似，则保护力比较差。在蓝耳病的灭活苗使用中，如果没有合适的高效的免疫佐剂，其免疫效果更差。弱毒疫苗的优点是：能在体内繁殖，产生抗体快，成本低，免疫期长。但是弱毒疫苗接种后，存在猪场带毒的危险，而且免疫后监测指标又无法与野毒感染相区分。有些学者认为，蓝耳病弱毒疫苗免疫后会对母猪的繁殖性能和公猪的精子活力造成影响，所以弱毒苗的安全性和效力不可靠，不主张接种弱毒疫苗。

另外，蓝耳病病毒侵害巨噬细胞，影响机体的免疫反应，据临床使用结果表明，蓝耳病弱毒苗和猪瘟弱毒苗同时免疫后会导致猪瘟的免疫效果下降，在猪瘟的控制上造成了很大困难。

人-5型腺病毒载体与其他动物病毒载体相比，具有许多优点。首先是安全，腺病毒毒性低，基本不致病或只引起轻微的症状，腺病毒重组后，毒力进一步降低，并且克服了逆转录病毒载体因随机整合可能导致插入突变的潜在风险；其次是宿主范围广，腺病毒可感染多种细胞包括分裂与非分裂细胞；第三是稳定，腺病毒粒子十分牢固，不易突变，并且容易大量制备并纯化，得到高滴度的病毒，在体外可获得10¹¹pfu/mL；第四就是对于腺病毒基因组的结构和功能目前研究得比较清楚，基因操作方便；第五是插入外源基因容量大。在基因治疗构建重组疫苗中大多采用缺失E1和E3区基因的腺病毒载体，通常复制缺陷型腺病毒可容纳约7kb～8kb的外源基因，比逆转录病毒和腺相关病毒的容量大很多；还有免疫途径简便，腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖，疫苗接种简便，可口服或气雾吸入而不需注射，并且经口服后能产生局部黏膜免疫应答，在免疫方法上比其它疫苗好，容易于推广使用。