[发明专利]结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，具体地说是一种结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法，以及该融合蛋白在结核亚单位疫苗中的应用。

背景技术

结核病是全球传播范围最广、持续时间最久、危害最为严重的传染病。自上世纪80年代以来结核病死灰复燃，发病率和死亡率据各类传染病首位和第二位。据估计，每年有2百万人死于结核病感染；更为严重的是每年有大约20亿人处于结核分支杆菌感染的潜伏期，其中有5-10％潜伏期结转变成活动期结核。我国是结核病高负担的国家之一，发病率约达到全国总人口的1‰。由于细菌变异，部分结核病患者使用常规化学药物治疗不能治愈，持续排菌，对个人健康和公共卫生造成了极大的威胁。因此，研制和开发抗结核疫苗尤其是针对休眠期结核的疫苗是控制结核病的重要途径。

目前研制成功的唯一的结核病疫苗——卡介苗(BCG)，虽然已在全球范围内广泛使用，然而不同研究显示，BCG在不同人群中的保护性不稳定，尤其是对成人肺结核的保护效率介于0-80％不等。现阶段进行研究的结核病疫苗主要有以下几种：(1)重组BCG；(2)结核杆菌减毒活疫苗；(3)结核亚单位疫苗。其中结核亚单位疫苗包括蛋白疫苗、DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗三种形式，其中蛋白疫苗因成份明确、相对安全，更易于被人们接受。

大量研究表明，利用基因工程技术将具有不同优势的单个结核菌保护性抗原进行重组，可构建成具有较强免疫原性和更好保护效应的融合蛋白。因此，抗原选择是构建结核亚单位疫苗的首要步骤之一。

发明内容

本发明的目的在于构建并表达纯化融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3，针对结核分枝杆菌各生长期的免疫应答，尤其是对休眠状态细菌建立有效的免疫应答，并且提高单个抗原的保护效果；融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3(MH)和佐剂(DDA+TDM)混合作为结核亚单位疫苗，能诱导较强的Th1型细胞免疫为主的细胞免疫反应和体液免疫反应，具有较好的动物保护效果，作为后期临床研究尤其是针对休眠期结核的候选亚单位疫苗。

本发明所选用的结核杆菌抗原Mtb10.4、Hsp16.3均有较强的免疫保护性，分别主要表达于生长期和休眠期且具有不同的免疫优势。两抗原主要特性如下：(1)Mtb10.4：Mtb10.4抗原是结核分支杆菌早期分泌性蛋白，属于ESA T-6蛋白家族，该家族包括ESAT-6，CFP-10， TB10.4，TB10.3等蛋白。相关研究证明Mtb10.4抗原是重要的结核分枝杆菌免疫保护性抗原，是理想的构件结核疫苗的候选抗原。Mtb10.4抗原对BCG接种的健康者和结核分枝杆菌感染的患者均可诱导强烈的细胞及体液免疫反应，与ESAT-6抗原相比是更好的结核疫苗候选抗原。将其免疫小鼠，可获得明显的特异性体液和细胞免疫反应，此外小鼠在用气雾攻击结核杆菌H37Rv毒株后，可获得接近BCG的免疫保护效果。(2)Hsp16.3：是热休克蛋白(Hsp)的一种，在细菌休眠期和缺氧环境下高表达，对于结核菌在巨噬细胞内的持续存在起重要作用。Hsp16.3能够激起Th1型细胞反应，刺激高水平的IFN-γ的分泌。在健康的与肺结核密切接触的家人(80％)和医务工作者(90％)中，具有较高比例的HspX T细胞刺激活性，比例明显高于普通人群(50％)，提示Hsp16.3抗原具有免疫保护作用。

本发明的技术方案为：

结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法为：

首先，将Mtb10.4和Hsp16.3基因进行PCR扩增并依次插入到克隆载体的多克隆位点中，

构建重组载体；

然后将上述重组载体在大肠杆菌中表达融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3；

最后根据融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的分子量、电荷和亲和力进行纯化，通过纯化得到融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3。

所述的融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建方法包括以下步骤：

(1)根据GenBank中H37Rv中的Mtb10.4和Hsp16.3的基因序列，设计引物；

(2)PCR扩增Mtb10.4基因：由于Mtb10.4基因后面要融合Hsp16.3，所以设计引物时把Mtb10.4终止信号去掉；以结核杆菌标准毒株DNA为模板，用5`端特异性引物Mtb10.4F和3`端引物Mtb10.4R扩增Mtb10.4全基因序列；