[发明专利]结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法及其应用

权利要求书

1.结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法，其特征在于：

首先，将Mtb10.4和Hsp16.3基因进行PCR扩增并依次插入到克隆载体的多克隆位点中，构建重组载体；

然后将上述重组载体在大肠杆菌中表达融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3；

最后根据融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的分子量、电荷和亲和力进行纯化，通过纯化得到融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法，其特征在于所述的融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建方法包括以下步骤：

(1)根据GenBank中结核杆菌标准毒株H37Rv的Mtb10.4和Hsp16.3的基因序列，设计引物；

(2)PCR扩增Mtb10.4基因：以结核杆菌标准毒株H37Rv DNA为模板，用5`端特异性引物Mtb10.4F和3`端引物Mtb10.4R扩增Mtb10.4全基因序列；

PCR反应条件：96℃预变性1min，98℃变性10s，54℃复性15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；PCR产物经胶回收试剂盒纯化进行纯化；

(3)构建重组质粒Mtb10.4-pET-30a：用Nde I和Sac I双酶切纯化后的Mtb10.4基因和质粒pET30a，在T4连接酶的作用下将两者进行连接，转化入E.Coli DH5α(DH5α为大肠杆菌E.Coli的一个菌属)中，构建重组质粒Mtb10.4-pET-30a(+)，PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定；

(4)PCR扩增Hsp16.3基因：以结核杆菌标准毒株DNA为模板，用Hsp16.3F和Hsp16.3R扩增Hsp16.3基因片段；

PCR反应条件：96℃预变性1min，98℃变性10s，55℃复性20s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；PCR产物经胶回收试剂盒纯化；

(5)构建重组质粒Mtb10.4-Hspx-pET-30a(+)：用Sac I和HindIII双酶切纯化后Hspx基因和重组质粒Mtb10.4-pET-30a(+)，分别纯化后用T4连接酶进行连接，转化入E.Coli DH5α，克隆构建重组质粒Mtb10.4-Hspx-pET-30a(+)；PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定。

3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法，其特征在于所述的融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的表达方法包括以下步骤：

(1)从以上E.Coli pET30a-Mtb10.4-Hsp16.3提取重组质粒pET30a-Mtb10.4-Hsp16.3，转化入E.Coli中，PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定；

(2)活化表达MH蛋白的E.coli菌体，取活化后菌体加入培养基中震荡培养；诱导振荡培养，离心收集菌体；菌体重悬于缓冲液中，冰浴下超声破碎细菌，离心后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

4.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的构建、表达和纯化方法，其特征在于所述的融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的纯化方法包括以下步骤：

(1)配制以下缓冲液：I液20mM PB；II液20mM PB+1M NaCl；III液20mM PB+2M NaCl；缓冲液均用滤器过滤除菌；

(2)大量表达融合蛋白MH，收集的菌体重悬于缓冲液中，冰浴下超声破碎，离心后收集含MH蛋白的上清，上清用滤器过滤除菌；

(3)第一步纯化离子交换层析：选用强阴离子交换柱Q介质进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得初步纯化物；

(4)第二步纯化疏水层析：经过离子交换层析初步纯化后的蛋白，加入等体积的III液，使蛋白含高盐上柱，选用Butyl HP柱进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得二步纯化物；

(5)第三步纯化凝胶过滤层析：将经过离子交换层析和疏水层析两步纯化后的蛋白，选用superdex 75柱进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得最终纯化物；

(6)将最终得到的蛋白纯化物测定浓度之后即可使用。

5.结核分枝杆菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3在结核亚单位疫苗中的应用。