[发明专利]一种链霉菌微型转座突变系统及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种转座突变系统及其构建方法，以及其在链霉菌中的应用。

背景技术

用传统的方法如物理或化学诱变，定点突变等发现和研究链霉菌的基因

繁琐，效率低下。转座子是目前遗传突变中一种行之有效的工具，研究人员陆续发现和分离出可以用于链霉菌中的转座子，但是现有的一些转座系统普遍存在多次转座、效率不高、操作复杂并且来自异源的转座子会受到链霉菌强烈的限制修饰系统的修饰而无法作用等问题，使得链霉菌中的转座系统得不到普遍应用，筛选突变和阐明基因功能的工作进展缓慢。

本发明中应用的转座酶的名称为IS204,来源于Nocardia asteroids(一种诺

卡式菌).根据文献报道,IS204的开放读码框的长度为1134个碱基,两端各有一个23个碱基的反向重复序列(IRL,IRR).在插入的靶位点处会产生一段8bp的正向重复序列，并且IS204在诺卡氏菌中转座效率很高。

为便于研究链霉菌功能基因,避免效率低,假阳性等问题,构建高效的转座突变系统具有很高的实用价值。由于诺卡氏菌和链霉菌都属于放线菌，所以推测IS204也可以在链霉菌中发生高效转座。本着这个思路，我们利用IS204构建了一个用于链霉菌的高效微型转座系统，并对其转座机理进行了研究。

发明内容

本发明的目的是提供一套简便高效的研究链霉菌功能基因的系统，此系统克服了常规方法的上述问题，应用此系统可在短时间内筛选到足够数量的随机突变，而且用简单的方法即可得到突变位点的核苷酸信息。

本发明首先提供一对IS204的转座酶识别序列，为IRL和IRR位点，其序列分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。

本发明提供一个用于转座的质粒，由基于上述的转座酶识别位点序列所构建，序列如SEQ ID No. 20所示，记为pDZY101。

所述转座质粒的相应元件，包括质粒复制起始位点、抗药性基因、转座酶基因、接合转移起始位点、红霉素启动子以及转座酶识别位点IRL、IRR^-1和IRR。

构建一套研究链霉菌功能基因的转座突变系统包括下述步骤:(1)抽提Nocardia asteroids的基因组DNA,然后以该基因组DNA作为模板,用引物SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6 从Nocardia asteroids的基因组中PCR扩增出长度为1354bp的转座酶片段,然后将该片段插入到pMD19-T中,并在该基因片段上游插入红霉素启动子。在转座酶下游的一段包含有大肠杆菌复制子和硫酸安普霉素的片段两旁分别插入IRL和IRR,使IRL和IRR的序列方向呈反向重复。构建完成后的质粒称为pDZY101 ,将该质粒转化大肠杆菌ET12567, 挑单菌落与天蓝色链霉菌M145进行接合转移, 抗性筛选。结果显示,转座效率稳定地达到10^-5 ,挑菌落扩大培养后抽提基因组,用合适的限制性内切酶酶切后,热失活,用T₄DNA连接酶进行片段自连,然后转化大肠杆菌,抗性筛选。挑单菌落提质粒后用引物SEQ ID No. 7测序,结果表明,由于在pDZY101中转座酶尾部18bp的序列恰好与其下游的IRR呈反向重复,因而转座酶特异性地作用于这两个位点,而对IRL则不发生作用,其结果是pDZY101整个作为一个的插入序列插入到链霉菌基因组中。另外通过比较插入靶位点的序列,确定为随机插入。

本发明将1354bp的转座酶片段做成地高辛标记探针,对筛选到的链霉菌的基因组DNA进行Southern blot,结果表明pDZY101作为一个转座序列在靶基因组中均只插入一次。

本发明通过PCR,将转座酶3’端18bp的碱基缺失突变后发现转座不能发生。

本发明将IRR和转座酶3’端300bp一起转移至原来IRL的位置,并保持原来位置处的转座酶3’端为缺失突变,结果表明转座特异性地发生在转移之后的转座酶和IRR处。

根据以上结果,本发明证明该转座酶只能特异性地作用于紧靠着的两端反向重复序列。

在上述结果的基础上,本发明还构建了一系列可用于转座的质粒,即pDZY101的衍生质粒，分别记为pDZY102~ pDZY107。

附图说明

图1：转座质粒pDZY101结构图。

图2：转座质粒pDZY101衍生质粒pDZY102结构图。