[发明专利]用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染源的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染来源的方法，具体地说，涉及一种包括大肠杆菌分离纯化步骤、已知源大肠杆菌基因指纹图谱库的建立步骤和海洋水体粪便污染溯源分析步骤的利用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染来源的方法。

背景技术

微生物源示踪法(Microbial source tracking，MST)20世纪80年代首先在欧美等国家兴起并逐步发展。MST是利用微生物在环境中的生化特性、遗传多样性及其特异性代谢产物确定细菌宿主来源的一种技术，它尤其对非点源粪便污染的监测与管理起到了不可比拟的作用。MST的基本原理是：生活在不同宿主环境中的同一种微生物为了适应所处的特异性生态环境，产生了一系列环境适应性，并将这些特性以传给子孙后代，进而形成一个区别于其他环境的同种微生物群，这些微生物会形成适应生存环境特异性指纹图谱，通过分析这些特异性指纹图谱就能够达到识别微生物污染源的目的。MST的基本路线为首先建立已知物种源指示生物特异性指纹图谱库，用样本的指纹图谱与标准库里的特异性图谱进行比较，用同源相似率详识别污染水体的粪便来源。

MST的常用示踪因子——大肠杆菌。大肠杆菌(E.coli)即大肠 埃希氏菌，为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。大肠杆菌为人等温血动物肠道中的常居菌，其常在婴儿或初生动物出生后几个小时即可从口腔进入消化道，并在消化道的后端大量繁殖并终生存在。大肠杆菌由于经常随粪便排出体外，能广泛传播于外界环境，所以大肠杆菌是国际上水质监测的重要指标之一。大肠杆菌分子结构较为简单，其DNA是一条完整的DNA链，作为分子生物学的模式菌，人类对其研究得较为透彻。因此，综合以上因素，大肠杆菌通常被人们选为MST的首选示踪因子。

MST指纹图谱技术--REP-PCR扩增法。基因指纹图谱是用PCR扩增环境微生物样品总DNA的标记序列，然后用合适的电泳技术将其分离而成的具有特定条带特征的图谱。基因指纹模式的不同就反映细菌种属的不同。细菌基因组重复序列PCR扩增法(PCR of repetitive sequences，rep-PCR)是Versalovic于1996年描述的一种细菌基因组指纹分析法，它利用DNA引物互补扩增出自然存在的、高度保守的、重复片段DNA序列(这些序列为多拷贝序列，在革兰氏阴性菌中大多存在，而在革兰氏阳性菌中很少存在)，通过电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异。35-40bp的重复性基因外回文序列(repetitive extragenic palindromic，REP)是重复序列的一种主要类型。REP-PCR这一技术可信度高、重现性好、快速、分辨能力高，一直是MST研究中比较推崇的基因型指纹图谱技术。

发明内容

本发明目的是提供一种利用大肠杆菌rep-PCR基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染来源的方法，该方法包括：

大肠杆菌分离纯化步骤，在该步骤中，选择合适梯度体积的 粪便样本，采用滤膜法，以带栅格纤维滤膜和m-TEC琼脂培养基为基质进行菌种分离培养后，挑取符合大肠杆菌形态特征的菌落，以LB琼脂培养基为基质进行2～3次纯化，对经生化鉴定后确定为大肠杆菌的菌株进行保存；

已知源大肠杆菌基因指纹图谱库的建立步骤，在该步骤中，采用传统的苯酚-氯仿抽提法提取大肠杆菌基因组DNA，用特定引物进行聚合酶链反应，采用缓冲液、染色液以及琼脂糖凝胶进行聚合酶链反应产物电泳，采用暗箱透射紫外照射进行琼脂糖凝胶成像，从而获得各菌株的基因指纹图谱，构建已知源大肠杆菌基因指纹图谱库；

海洋水体粪便污染溯源分析步骤，在该步骤中，采用数据分析软件，将从海洋水体样本中分离得到的未知源大肠杆菌基因指纹图谱与已知源大肠杆菌基因指纹图谱库进行比对，依据相似性大小排序确定其最大可能来源，并据此对采样海域水体中的粪便污染进行溯源。

本发明的大肠杆菌分离纯化步骤包括：

1.选择合适梯度体积的粪便样本，采用滤膜法，以m-TEC琼脂培养基为基质进行菌种分离培养后，挑取符合大肠杆菌形态特征的菌落，以LB琼脂培养基为基质进行2～3次纯化，对经生化鉴定后确定为大肠杆菌的菌株进行保存；

2.在大肠杆菌生化鉴定中，对每株菌均需进行氧化酶试验、西蒙氏枸橼酸盐试验、吲哚试验、EC肉汤发酵试验共4种实验，对4种实验要求均完全满足的为大肠杆菌。

本发明的大肠杆菌分离纯化步骤可以大批量处理粪便样本，实现对大肠杆菌的快速分离与纯化。

本发明的已知源大肠杆菌rep-PCR基因指纹图谱库的建立步 骤包括：