[发明专利]用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染源的方法

权利要求书

1.一种用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染源的方法，该方法包括：

大肠杆菌分离纯化步骤，在该步骤中，选择合适梯度体积的粪便样本，采用滤膜法，以带栅格纤维滤膜和m-TEC琼脂培养基为基质进行菌种分离培养后，挑取符合大肠杆菌形态特征的菌落，以LB琼脂培养基为基质进行2～3次纯化，对经生化鉴定后确定为大肠杆菌的菌株进行保存；

已知源大肠杆菌基因指纹图谱库的建立步骤，在该步骤中，采用传统的苯酚-氯仿抽提法提取大肠杆菌基因组DNA，用特定引物进行聚合酶链反应，采用缓冲液、染色液以及琼脂糖凝胶进行聚合酶链反应产物电泳，采用暗箱透射紫外照射进行琼脂糖凝胶成像，从而获得各菌株的基因指纹图谱，构建已知源大肠杆菌基因指纹图谱库；

海洋水体粪便污染溯源分析步骤，在该步骤中，采用数据分析软件，将从海洋水体样本中分离得到的未知源大肠杆菌基因指纹图谱与已知源大肠杆菌基因指纹图谱库进行比对，依据相似性大小排序确定其最大可能来源，并据此对采样海域水体中的粪便污染进行溯源。

2.根据权利要求1所述的用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染源的方法，其中在大肠杆菌分离纯化步骤的大肠杆菌生化鉴定中，对每株菌均需进行氧化酶试验、西蒙氏枸橼酸盐试验、吲哚试验、EC肉汤发酵试验共4种实验，对4种实验要求均完全满足的为大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染源的方法，其中在已知源大肠杆菌基因指纹图谱库的建立步骤中，聚合酶链反应选用的引物序列为

REP 1R：5’-IIIICGICGICATCIGGC-3’

REP 2I：5’-ICGICTTATCIGGCCTAC-3’

其中，I为次黄嘌呤。

4.根据权利要求1所述的用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染源的方法，其中在已知源大肠杆菌基因指纹图谱库的建立步骤中，聚合酶链反应产物电泳采用0.5×TBE缓冲液或是0.5×TAE缓冲液；DNA染色液采用万分之一的核酸染料或相当级别的DNA染色液；琼脂糖凝胶要求长度12cm，梳子齿宽≥4mm；上样量为10μL；稳压电源进行电泳。

5.根据权利要求1所述的用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染源的方法，其中在已知源大肠杆菌基因指纹图谱库的建立步骤中，琼脂糖凝胶成像采用暗箱透射紫外照射，像素百万级以上。

6.根据权利要求1所述的用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染源的方法，其中在已知源大肠杆菌基因指纹图谱库的建立步骤中，对图谱库的分析应用数据分析软件，采用判别分析法以源验证和交叉验证得到的平均正确归类率评估已知源大肠杆菌rep-PCR基因指纹图谱库的归类准确性。

7.根据权利要求1所述的用大肠杆菌基因指纹图谱识别海洋水体粪便污染源的方法，其中在海洋水体粪便污染溯源分析步骤中，采用判别分析法进行未知源菌株的归类识别。