[发明专利]重组杆菌溶素的表达和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地，本发明涉及一种重组蛋白的表达和应用。

背景技术

杆菌溶素的定义是在中性(pH值在7附近)条件下具有分解蛋白质的一类酶的总称。其来源为大肠杆菌，本发明中的杆菌溶素基因来自芽孢杆菌属。杆菌溶素蛋白分子量约为35KDa，最佳PH值为7.0。杆菌溶素的用处非常广泛，本发明中的杆菌溶素是用于糖化血红蛋白检测试剂盒。这就需要从这一类的蛋白酶中选取能特异性的切割糖化血红蛋白的β链N-末端糖化缬氨酸残基的杆菌溶素酶。

血糖试剂盒中包含有两种酶：杆菌溶素和果糖缬氨酸氧化酶。反应原理是首先用杆菌溶素把糖化血红蛋白β链N-末端的糖化缬氨酸残基切割下来，然后糖化的缬氨酸作为果糖缬氨酸氧化酶的反应底物，被特异性地清除N-末端的氨基酸并且产生过氧化氢，然后通过检测过氧化氢的量计算血糖的浓度。糖化血红蛋白检测试剂盒是用于检测人全血中的糖化血红蛋白的浓度。

糖尿病及其并发症是危害我国人体健康的重要疾病，也是我们日常生活中常见的一种难以完全治愈的疾病，近年来其发病率持续增高，一旦患病，会给人们甚至是整个家庭的幸福罩上极大的阴影。中国中医科学院糖尿病研究总院，通过对近5万名20岁以上的人群进行血糖检测，糖尿病的总患病率已达11.28％。因此对其进行诊断、检测和治疗具有重要意义，也必定会带来不容忽视的市场价值。

糖化血红蛋白(HbAlc)则是血液中与葡萄糖结合了的那部分血红蛋白，是β链N端缬氨酸与葡萄糖进行的非酶缩合反应，先形成不稳定的Shiff碱，然后经过Amadori重排，形成稳定的酮氨化合物，它们的结合缓慢而不逆。HbAlc不受血糖浓度暂时的波动的影响，可以反映测定前8-12周血糖的平均水平，与抽血时间，患者是否空腹，是否使用胰岛素等因素都无关，因而是判定糖尿病长期控制的良好指标。在国外，已经将HbAlc监测作为糖尿病治疗判定和调整治疗方案的“金标准”。非糖尿病人的HbAlc为4-5.5％，老年人在7.0-7.5％为正常值。

杆菌溶素基因分为两部分，前面的分泌肽和后面的成熟肽部分，分泌肽的作用是使细胞内生成的杆菌溶素分泌到胞外。现有技术中的生产杆菌溶素的方法都是将杆菌溶素的基因全部表达，因为杆菌溶素对细胞有毒性，所以细胞为了生存，表达杆菌溶素的量很小，以便尽可能降低对细胞的毒害，并且因为是分泌到胞外的培养液中，所以表达出来的杆菌溶素浓度低，并且难以进一步浓缩。另外，现有技术的方法一般通过对芽孢杆菌发酵生产再纯化的方法制备产品的，例如申请号200810234458.8(公开号：CN 101407800A，公开日2009年4月15日)的中国专利申请中记载：“本发明是一种来自海洋的多粘类芽孢杆菌L1-9(Paenibacillus polymyxa isolate L1-9)产中性蛋白酶方法，其步骤包括菌株活化、种子液的制备、产酶培养基的制备和产酶发酵培养和粗酶液的制备。”这类方法一般纯度低，成本高。因此，需要对杆菌溶素的基因和表达进行进一步研究以提供获得杆菌溶素的新方法。

发明内容

本发明运用基因工程技术只截取杆菌溶素基因中的成熟肽部分，去掉分泌肽部分，表达纯化大量稳定的重组杆菌溶素包涵体，并对其进行复性，得到了有活性的稳定的杆菌溶素。因此，本发明提供一种杆菌溶素基因和该基因表达的重组蛋白及其制备方法。通过本发明的方法得到的杆菌溶素具有易纯化、产量大、活性高的特点。

因此，本发明一方面提供一种截短芽孢杆菌的杆菌溶素基因，该基因具有如SEQ ID NO：1所示的核酸序列。

SEQ ID NO：1：