[发明专利]EV71疫苗制备方法及通过该方法制备的疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及以毕赤酵母为表达体系，利用不同启动子共表达密码子优化后的EV71的P1与3CD蛋白，并得到具有免疫原性的病毒样颗粒疫苗的制备方法。还涉及通过该方法制备的疫苗。

背景技术

肠道病毒71型(EV71)属小RNA病毒科肠道病毒属，主要引发手足口病与无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等中枢神经系统疾病，致残及病死率较高，是危害程度仅次于脊髓灰质炎病毒的嗜神经性肠道病毒。EV71以人类为唯一宿主，主要传播途径为粪-口传播。人群对EV71普遍易感，但其主要感染对象为5岁以下婴幼儿。自1974年首次报道以来，EV71已经在全球引起十多次规模性爆发，仅在中国，就曾经于1998年与2007-2008年分别在台湾与山东等地造成数万人次感染，而在某些研究报告中，EV71在中国部分地区的发病率高达10％。

EV71病毒颗粒为无包膜二十面体对称球体，由60个相同的亚单位构成。其病毒基因组为单股正链RNA，长约7400bp，只有一个阅读框和位于5’和3’的非编码区，编码一个多聚蛋白，包含3个前体蛋白P1-P3，P1编码VP1-VP4四个衣壳蛋白，P2和P3编码7个非结构蛋白，包括2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。其中3CD为特异性蛋白水解酶，识别Gln-Gly位点，分解P1前体蛋白，使其释放出组成病毒衣壳亚单位的VP1-VP4，最终完成病毒颗粒的组装。

根据基因序列同源性差异，可将EV71分为A、B、C三种基因型，其中B型与C型又可进一步细分为B1-B5、C1-C4亚型。不同基因型的流行趋势呈现一定的地域差异，而同一地区不同时间流行的EV71基因型又有所不同。但是从1997年开始，EV71在中国的流行趋势较稳定，主要以C4型为主。

由于EV71的致病机理与免疫机制有待进一步揭示，所以到目前为止，仍无有效的抗病毒药物和预防病毒感染的疫苗。近年来，也有不少研究表明在EV71疫苗研究上取得了一些进展，包括灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗和减毒活疫苗。其中最高效和安全的疫苗研究方向为重组病毒样颗粒(VLPs)疫苗。

病毒样颗粒是无病毒基因组的具有完整立体结构的衣壳蛋白组成的颗粒结构，既无感染性，又保留了衣壳蛋白上的抗原表位，并且结构稳定，因此相较于传统减毒或灭活疫苗具有更可靠的安全性，而相较于其他重组疫苗，其免疫原性的优势也非常明显。自从1985年发现乙肝病毒(HBV)表面抗原(Surface Antigen，HBsAg)颗粒被发现可作为乙肝疫苗以来，VLPs技术在新型病毒疫苗的研究中迅速发展。比较典型的成功利用病毒样颗粒作为疫苗的例子是人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒，不少研究结果显示，包括大肠杆菌、酵母和杆状病毒在内的许多表达系统都可表达重组HPV晚期蛋白L1与L2，得到具有病毒颗粒结构的L1/L2-VLPs或L1-VLPs，这些病毒样颗粒与铝佐剂一起免疫宿主后，都可以诱导机体产生高滴度的中和抗体，达到良好的保护作用。

90年代初，David C.Ansardi等人成功地在Hela细胞中表达得到与EV71病毒结构非常类似的同属小RNA病毒科的脊髓灰质炎病毒的VLPs，其主要策略是共转染带有编码脊髓灰质炎病毒P1前体蛋白与P3前体蛋白基因的重组载体，结果证明P3前体蛋白中的3CD蛋白酶复合体发挥特异性蛋白水解酶功能，将共表达的P1前体蛋白分解为VP1，VP0与VP3蛋白，并最终在电镜观察中获得形态均一的病毒样颗粒。在2003年，Yuchen Hu等人在昆虫细胞中共转染带有EV71P1与3CD基因的重组杆状病毒后，同样得到EV71病毒样颗粒。但是昆虫细胞表达系统的主要缺点是瞬时表达，病毒感染最终会导致宿主表达细胞死亡，因此必须重新启动感染，每一轮蛋白质的生产都必须再感染新培养的细胞，成本昂贵，生产周期长，而且文献报道的使用昆虫细胞的EV71病毒样颗粒表达量大约10mg/10⁹细胞，表达量低，在工业化生产中有一定问题。

发明内容

本发明将P1前体蛋白编码基因与3CD蛋白酶编码基因克隆至毕赤酵母表达载体中，双表达后成功得到形态均一稳定且具有免疫原性的病毒样颗粒，此结论也证明了EV71病毒颗粒的组装仅需要P1前体蛋白与3CD蛋白酶。