[发明专利]南方型玉米锈病病原真菌的检测引物及分子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种南方型玉米锈病病原真菌的特异引物及分子检测方法。

背景技术

玉米锈病是全球范围内越来越严重的一种玉米真菌病害。至今已报道的玉米锈病有 3种，即由玉米柄锈菌 (Puccinia sorghi Schw．)引起的普通玉米锈病,由玉米多堆柄锈菌 (Puccinia polysora Underw.)引起的南方玉米锈病和由玉米壳锈菌 [Physopella zeae(Mains) Cummins ＆ Ramachar]引起的热带玉米锈病。

我国玉米锈病发生范围较广，遍及南北主要玉米产区，主要有普通型锈病和南方型锈病两种类型，普通型锈病多发生在低温高湿的东北、西北玉米区；南方型锈病在我国台湾、海南、云南元江最先发生。近年来，玉米锈病在我国的危害逐渐加重，如随着杂交玉米的推广和玉米种植制度的变化，玉米锈病在我国海南、江苏、河南、山东、山西、河北、浙江等省大面积暴发，造成当地玉米产量锐减。锈病尤其南方型锈病对产量的影响有时是毁灭性的，玉米锈病发病中度的田块，可以减产10% ～20%，感病较重的可以达到50%以上，部分地块甚至绝收。

玉米锈病真菌感染14天之后才能够在玉米叶片观察到病斑，但是此时进行农药喷施，不足以控制病情的蔓延，如果能够在玉米锈病病原菌感染早期，及时、准确的进行检测鉴定，可以做到提前预防，如选择敏感有效的杀真菌剂，以控制病情的流行大爆发。因此，建立一种能够快速、准确的监测和鉴别玉米锈病病菌的检测方法对于我国玉米的安全生产具有重大的意义。

近年来，随着分子生物学技术向植物病理学科的不断渗透，特别是相关的分子标记技术的发展与应用，为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径。PCR技术以其特异性强、敏感性高的特点很早就被研究用于病原真菌的诊断。近年来的有关报道更是层出不穷，显示了很广阔的应用前景，如中国专利文献CN1880476C中公开了一种松树脂溃疡病菌的分子检测方法；CN101643788 A中公开了一种马铃薯晚疫病菌分子检测引物及其用法。但有关玉米锈病菌的分子检测研究目前国内外尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好的南方型玉米锈病病原真菌的检测引物，并给出了一种可快速、准确鉴别检测出南方型玉米锈菌的分子检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

针对南方型玉米锈病病原真菌的设计出一对检测引物，其核苷酸序列如下（如SEQ ID NO:2、3所示）：

上游引物：5’- CTCCAAGAACTTCCTCCTC -3'，

下游引物：5’- TGACATGAAGTAGAAATTCT -3'。

与上述检测引物相对应的南方型玉米锈病病原真菌的DNA特征片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述上游引物和下游引物对南方型玉米锈病病原真菌特异性扩增出约540 bp左右的产物。

所述检测引物可在对南方型玉米锈病病原真菌的鉴别和检测中的应用。

一种南方型玉米锈病病原真菌的分子检测方法，包括以下步骤：

 提取玉米叶片基因组DNA；

 PCR扩增，分别在PCR薄壁管中依次放入：

10′Buffer 2.5μL、25mmol/LMgCL₂ 2.0μL、2.5mmol/LdNTP 2.0μL、前述上游引物和下游引物2mmol/L各2.5μL、玉米叶片基因组DNA 10～50ng、Taq DNA聚合酶1.0U，最后以无菌去离子水补齐至25μL；离心10sec后进行PCR扩增；扩增条件为：第一循环95℃预变性5min；然后94℃变性 45sec，55℃退火45sec，72℃延伸 90sec，共30个循环；最后一循环，72℃延伸10min补齐末端，扩增完成；

 上步所得PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上用1×TAE缓冲液中电泳分析，电压为4～5V/cm，电泳结束后用凝胶成像系统分析；

④ 在544 bp处出现特异条带，说明玉米叶片带南方型玉米锈病病原真菌，反之，则不携带该病原真菌。

本发明具有积极有益的效果：

1.本发明所用探针（引物）对玉米条锈菌具有很强的特异性，能够用于区别玉米南方锈病病菌和玉米普通锈病病菌及玉米大斑病菌，玉米小斑病菌，玉米弯孢霉菌等玉米上的常见病菌；可用于玉米锈病的检测，并且其灵敏度可达0.001ng/μL。

2.本发明检测方法实用性好，操作简便快速，测试成本较低。

附图说明