[发明专利]一种整合牛NRAMP1巨噬细胞特异性表达载体/牛成纤维细胞及其方法

权利要求书

1.一种整合牛NRAMP1巨噬细胞特异性表达载体，其特征在于：其包含巨噬细胞特异性启动子SP以及HA标签的目的基因NRAMP1。

2.根据权利要求1所述整合牛NRAMP1巨噬细胞特异性表达载体，其特征在于：还包括抗性筛选基因neo基因。

3.根据权利要求1或2所述整合牛NRAMP1巨噬细胞特异性表达载体，其特征在于：该载体通过用SacII和BamHI酶切将NRAMP1基因克隆到巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP载体上，然后用BamHI和NotI将EGFP切除掉而获得。

4.一种含有权利要求1所述载体的牛成纤维细胞，其特征在于：其宿主细胞是秦川牛耳朵皮肤成纤维细胞，通过脂质体转染的方法将目的基因NRAMP1整合到牛成纤维细胞的基因组中。

5.根据权利要求4所述牛成纤维细胞，其特征在于：所述的宿主细胞是5-8代的秦川牛耳朵皮肤成纤维细胞。

6.根据权利要求4或5所述牛成纤维细胞，其特征在于：该牛成纤维细胞作为核移植共体细胞构建转基因克隆胚。

7.一种整合牛NRAMP1巨噬细胞特异性载体的构建方法，其特征在于，该方法包括：

1)牛NRAMP1基因克隆

1.1)在牛NRAMP1基因的开放阅读框首尾两端设计分别含有SacII和BamHI酶切位点的引物，

正向引物1F：5’-CCGCGGGTCGCCACCATGTCAGGTGACACGGGC-3’；

反向引物1R：

5’-GGATCCCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATCCCGAGGTCCTCCCCTTCTC-3’：

1.2)取成体秦川黄牛脾脏中约10mg组织，采用Trizol方法提取脾脏组织中的总RNA，利用cDNA试剂盒反转录成第一链cDNA；

1.3)以cDNA为模板，用引物对1F和1R，用Triplemsaster system PCR扩增牛NRAMP1基因；反应条件是95℃，5min；95℃30sec；66℃30sec；72℃2min；36个循环；72℃延伸10min；4℃保存；

1.4)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，与pGEM-T Easy载体连接并转化到DH5α，经蓝白斑筛选挑选重组子，对EcoRI酶切鉴定为阳性的质粒进行测序，测序正确的阳性克隆命名为pGEM-T-easy-NRAMP1并用生物学软件进行序列分析；

2)牛NRAMP1巨噬细胞特异性载体构建

2.1)巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP

巨噬细胞特异性表达载体pSP-EGFP可以在巨噬细胞中表达，其中包含巨噬细胞特异性启动子SP；

以pSP-EGFP载体为骨架，通过插入目的基因NRAMP1并去掉EGFP构建NRAMP1巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMP1-HA；

2.2)含NRAMP1巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMP1-HA的构建

将pGEM-T-easy-NRAMP1，pSP-EGFP分别用SacII和BamHI双酶切，回收NRAMP1基因片段和载体，用T4DNA连接酶连接过夜，将连接产物转化入DH5α，用PstI酶切筛选阳性克隆；得表达载体pSP-NRAMP1-EGFP；

将pSP-NRAMP1-EGFP用BamHI和NotI双酶切并用Klenow补平，胶回收除去EGFP的载体并用T4DNA连接酶连接过夜，连接产物转化入DH5α，用XhoI和HpaI双酶切筛选阳性克隆，得pSP-NRAMP1-HA载体；

2.3)pSP-NRAMP1-HA载体的验证

小鼠巨噬细胞RAW264.7用含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，在37℃的CO₂孵箱中常规培养。将巨噬细胞接种于24孔板，24h后更换无血清的DMEM培养液，同时准备用脂质体-2000转染重组质粒pSP-NRAMP1-HA，转染48h后弃去培养液，PBS冲洗3遍，4％多聚甲醛固定10min；用10％山羊血清封闭15min，0.2％Triton X-100处理2min后用鼠源HA单抗4℃孵育过夜；用TRITC标记的抗鼠的二抗室温孵育1h，PBS洗5min×2次，用Hochest33342染核1min，然后用荧光显微镜观察NRAMP1的表达。