[发明专利]一种纤维堆囊菌高密度发酵与埃博霉素产物分离偶联的生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种纤维堆囊菌高密度发酵与埃博霉素产物分离偶联的生产工艺，属于发酵工程技术领域。

背景技术

1993年，德国国家生物技术中心(GBF)的G.等人报道了他们从粘细菌的纤维堆囊菌So.ce 90菌株的发酵液中，分离出来具有抑制真菌活性和细胞毒活性的Epothilone A和B(图1)。1995年，默克研究院的D.M.Bollag等在大规模筛选微管抑制剂时发现一株纤维堆囊菌SMP 44的发酵提取物具有抑制微管蛋白解聚、破坏有丝分裂的活性，经分析鉴定该活性组份为Epothilone A和B，它与紫杉醇具有相同的抑制肿瘤细胞生长的作用机制，并且比紫杉醇具有更多优点。2007有一种埃博霉素类B的衍生物伊沙皮龙经美国FDA批准上市，目前有六种埃博霉素类化合物进入了临床研究，埃博霉素类化合物在当今抗癌药物领域异军突起，该类化合物的大规模生产技术研究迫在眉睫。

但是，埃博霉素的产生菌纤维堆囊菌的代时长，生长缓慢，营养摄取率很低，氧的消耗比较少，发酵周期长，发酵时细胞浓度较低，野生型菌株发酵液中每毫升细胞数不大于10⁹个。国内外对纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素的研究较少。Gerth等1996年报道So ce90菌株发酵产生埃博霉素的检测产量为22mg/L，埃博霉素A和B的比例大约为2∶1。Gerth等还通过同位素标记的底物方法，阐述了埃博霉素的碳骨架的组成，并研究了几种主要天然埃博霉素之间的关系，为埃博霉素发酵过程中前体物质的添加，以及进一步阐明原始菌株中埃博霉素的代谢途径打下了基础。国内仅有零星几个专利报道过纤维堆囊菌发酵产生埃博霉素的技术(ZL02110068.3、ZL02110067.5、ZL200510100338.5)，但没有针对纤维堆囊菌高密度发酵和埃博霉素产物分离偶联生产工艺的报道。

发明内容

本发明针对当前纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素工艺中的不足，公开了一种纤维堆囊菌高密度发酵与埃博霉素产物分离偶联的生产工艺。

本发明的技术方案如下：

通过流加碳氮源物质和前体物质实现纤维堆囊菌的高密度发酵，使用可以多次循环利用的吸附树脂，实现埃博霉素产物分离，并将高密度发酵与产物分离偶联，解除终产物埃博霉素对纤维堆囊菌的反馈抑制，提高埃博霉素的产量。

具体工艺步骤为：

1.纤维堆囊菌菌种制备：埃博霉素生产菌株纤维堆囊菌So0157-2，由山东大学微生物技术国家重点实验室李越中教授提供，保藏于中国典型微生物保藏中心，编号CCTCC NO.M208078。菌种使用前经固态活化培养基在28-32℃培养5-7天活化，经液态种子培养基在30-32℃培养3-5天，当细胞量达到10¹⁰时接种发酵培养基，发酵罐装液系数70％，接种量为5-10％(V/V)，发酵周期7-9天。

如1所述的固态活化培养基为：土豆淀粉0.1-3％，大豆蛋白胨0.1-2％，葡萄糖0.1-2％，酵母膏0.2-1％，MgSO₄0.1-1％，CaCL₂0.1-1％；TE 1.0-2.0ml/L；pH7.0-8.0。加0.5-1.5％琼脂，121℃灭菌20min使用。

如1所述的液态种子培养基为：土豆淀粉0.1-3％，大豆蛋白胨0.1-2％，葡萄糖0.1-2％，酵母膏0.2-1％，MgSO₄0.1-1％，CaCL₂0.1-1％；TE 1.0-2.0ml/L；pH7.0-8.0。121℃灭菌20min使用。

如1所述的发酵培养基为：马铃薯淀粉0.1-4％、葡萄糖0.1-3％、蛋白胨0.1-2％、豆饼粉0.1-2％和脱脂奶粉0.1-2％，Na₂HPO₄0.01-1％、K₂HPO₄0.01-1％、MgSO₄0.1-1％、CaCl₂0.1-1％、FeCl₃-EDTA0.001-0.01％，pH调整7.0-9.0。121℃灭菌20min使用。

2.流加补料发酵：从发酵开始后的第30-70h补加浓度为2g/L的葡萄糖，每小时流加原始发酵液体积的0.01-0.1％。从发酵过程中的第70-120h添加前体营养物质混合液。该混合液放入发酵罐补料瓶内，灭菌后采用蠕动泵自动流加，每小时流加原始发酵液体积的0.01-0.05％。