[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，尤其涉及动物疫病的预防控制。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的以母猪发热、流产，断奶前、后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。1991年，荷兰学者Terpstra等人在感染猪体内分离到欧洲型PRRSV，命名为Lelystad病毒(Lv)；同年，美国学者Benfield等人分离到美洲型PRRSV，命名为VR-2332。目前猪繁殖与呼吸综合征已经在世界范围内流行，每年造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年我国暴发了由猪繁殖与呼吸综合征高致病性变异毒株(highly pathogenicPRRSV，HP-PRRSV)引起的以体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合征(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)，给我国养猪业造成了极其严重的打击。

传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和反转录-聚合酶链反应试验(RT-PCR)等，目前较为广泛使用的用来检测PRRSV的方法为RT-PCR，但多数方法在敏感性、特异性等方面存在不足，因此，建立一种特异性强、敏感性高、可靠性好的猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法意义重大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-PCR检测方法。此方法快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好，为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫情的监测、防控提供强有力的技术支持。

本申请涉及针对PRRSV美洲型、欧洲型毒株ORF7和3’UTR的引物对，用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。引物序列如下：

上游引物：5’-GAATGGCCAGCCAGTCAATC-3’

下游引物：5’-GTCGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3’

本申请提供一种能够特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出PRRSV的RT-PCR试剂盒以及一种检测PRRSV的方法。

具体的，该试剂盒包括：

(1)RNA提取试剂由裂解液6mL、洗液12mL和洗脱液1mL组成。

(2)RT-PCR反应试剂由RT-PCR反应液200μL、酶混合液15μL和矿物油300μL组成。

(3)电泳检测试剂由50×TAE电泳缓冲液20mL、染色液20μL、上样缓冲液50μL组成。

(4)阴性对照350μL、阳性对照350μL。

以上试剂的基本制备方法为：

1)裂解液按下列配方配制：

异硫氰酸胍                    11.82g

氯化钠                        1.16g

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液  2mL

灭菌双蒸水                    加至100mL

2)洗液按下列配方配制：

磷酸氢二钠                    71.6g

磷酸二氢钾                    31.2g

氯化钠                        9g

灭菌双蒸水                    加至1000mL

3)洗脱液按下列配方配制：

磷酸氢二钠                    71.6g

磷酸二氢钾                    31.2g

灭菌双蒸水                    加至1000mL

4)RT-PCR反应液按下列配方配制：

A)无菌DEPC水  12.5μL

B)2.5mmol/L dNTP 2.5μL(购自Promega公司，dATP、dCTP、dGTP、dTTP(统称为dNTP)浓度均为100mmol/L。将dATP、dCTP、dGTP、dTTP等体积混匀后，再用DEPC水稀释10倍，即为制备的2.5mmol/L dNTP)

C)10pmol/μL引物混合液  1.5μL