[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对，其特征在于引物序列如下：

上游引物：5’-GAATGGCCAGCCAGTCAATC-3’

下游引物：5’-GTCGCCCTAATTGAATAGGTGAC-3’

2.一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于包括如权利要求1所述的引物对。

3.如权利要求2所述的快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于上述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT-PCR反应试剂、电泳检测试剂、阴性对照、阳性对照。

4.如权利要求2-3之一所述的试剂盒，其特征在于：

(1)RNA提取试剂由裂解液6mL、洗液12mL和洗脱液1mL组成

(2)RT-PCR反应试剂由RT-PCR反应液200μL、酶混合液15μL和矿物油300μL组成

(3)电泳检测试剂由50×TAE电泳缓冲液20mL、染色液20μL、上样缓冲液50μL组成

(4)阴性对照350μL、阳性对照350μL。

5.权利要求2-4任一项所述的试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。

6.利用权利要求2-4任一项的试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法，包括：

(1)样品处理

组织样品处理：采集猪的肺、扁桃体、脑等脏器组织，称取待检组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rmp离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

细胞培养物处理：取细胞培养物100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

血清样品处理：取猪血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

阳性对照处理：取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

阴性对照处理：取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

(2)病毒RNA提取

取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5min。将全部液体吸入吸附柱中，吸附柱要套上收集管，13000rmp离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600μL洗液，13000rmp离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。向吸附柱中加入600μL洗液，13000rmp离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管，13000rmp离心2min。将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，在膜中央加入洗脱液25μL，室温静置1min，13000rmp离心30s，获得总RNA。

(3)RT-PCR操作程序

每份总体积20μL。取16.8μL RT-PCR反应液(用前混匀)、1.2μL酶混合液，2μL样品RNA。例如：n份样品(n＜10)，配制n+1份16.8×(n+1)RT-PCR反应液，再加入1.2×(n+1)酶混合液，混匀，取18μL分装成n份，分别加入2μL样品RNA。作好标记，加入矿物油20μL覆盖(有热盖的PCR扩增仪不用加矿物油)，在PCR扩增仪上进行以下循环：42℃45min，95℃3min；扩增条件为94℃30s，55℃30s，72℃30s；35个循环后，72℃延伸10min。

(4)电泳

称3g琼脂糖放于500mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液200mL(取4mL 50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200mL)，于微波炉中熔解，再加入10μL染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物15μL混合3μL上样缓冲液，点样与琼脂糖凝胶孔中，以(110～120)V电压于50倍稀释的TAE电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

(5)结果判定

在阳性对照出现436bp或401bp扩增带、阴性对照无条带带出现(引物带除外)时，实验结果成立。被检样品出现436bp扩增条带时为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，出现401bp扩增条带时为欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒，否则为阴性。

7.权利要求6所述的方法在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。