[发明专利]检测T细胞微小RNA150相对含量反映个体免疫状态的技术

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，是一种基于聚合酶链反应(PCR)的分子生物学方法，特别是涉及荧光定量的聚合酶链反应(Q-PCR)。通过微小RNA150(microRNA-150，miR-150)相对含量反映个体的T细胞免疫状态。在茎环引物3’端引入8个特异性核苷酸序列可以逆转录miR-150，并通过Q-PCR技术对miR-150进行扩增。在与U6非编码RNA的含量进行比较后，得出miR-150的相对含量。miR-150的相对含量可反映个体T细胞免疫状态。此方法可在72小时内对个体T细胞免疫状态进行评估，而且可以通过分选技术对不同的T细胞类型进行分析，达到更准确的评估效果。优化实验条件后，构建简单、准确的miR-150的相对定量检测试剂盒。

背景技术

microRNAs是机体对mRNA翻译出蛋白质的调节分子之一，成熟的microRNAs具有这种调节功能。microRNAs在细胞发育、肿瘤的发生、疾病进展等重要的生理、病理过程发挥了重要的作用。静止与激活的T细胞中microRNAs表达谱也不同，表现出显著的表达差异。microRNAs差异表达在T细胞的发育、免疫性疾病进展、免疫抑制等生理、病理过程中发挥了重要的影响作用。microRNAs的检测有可能成为诊断、治疗和预后判断的靶分子，在恶性肿瘤、免疫性疾病和病原体感染等常见疾病的病理过程和分子机制中有突出的研究价值。

评价个体免疫状态主要依赖以T细胞功能检测为基本的生物技术，但是目前各种检测方法都有明显缺陷，临床实验室主要通过检测淋巴细胞的比例来完成，突出的缺陷是不能反映老年人、免疫抑制药物治疗患者的免疫状态。国外开发出一种immunknow的检测方法，主要检测T细胞受刺激后ATP生成数量来评价免疫抑制治疗患者的免疫抑制程度，需要花费时间15-18小时的体外培养，而且需要特殊的仪器设备检测细胞ATP含量。总体来说，T细胞功能检测存在实验时间长、无法标准化、需要特殊仪器、价格昂贵等情况。通过建立开放的荧光定量PCR技术平台，结合创新的non-coding RNA检测方案，开发全新的检测方法。此方法依靠PCR技术的高灵敏性和荧光定量的效果，同时T细胞受刺激后non-coding RNA可以在细胞内快速生成，将整个实验的时间缩短为72小时，并可通过荧光定量PCR进行量化评分达到评价免疫状态的效果。

T细胞作为评价免疫状态的关键细胞，是各种免疫评价指标检测的主要对象。通过全血培养系统可以明显缩短标本处理时间，在刺激培养的时间内，通过磁珠阳选CD4+的T细胞，快速分离目的细胞并完成总RNA或短片段RNA的提取，并于荧光PCR仪器上进行检测。总结以上过程可以发现此方法可以有效的缩短实验时间、减少经济费用，试剂和仪器可开放使用。对个体免疫功能研究依赖快速、准确、简单的筛选技术和定量检测技术。但是成熟microRNAs仅有21-23个碱基片段，很难采用常规的核酸扩增技术进行表达差异分析和定量检测。通过芯片技术可以区分拷贝数大的microRNAs表达差异，但是需要大量的标本提取RNA。Q-PCR技术可以定量检测低拷贝的核酸片段，首先通过茎环引物对miR-150进行逆转录成cDNA，再通过Q-PCR进行相对定量。

目前，还未开发出准确、快速、简单、费用低廉的个体免疫状态评价技术。本发明基于Q-PCR技术，通过茎环引物3’端引入8个特异性核苷酸，可以逆转录miR-150，并通过一套引物进行Q-PCR分析，进行相对定量的检测，解决目前个体免疫状态评价的技术瓶颈。

发明内容

本发明的目的是克服现有免疫诊断技术和分子诊断技术中对个体免疫状态评价技术存在的不足，包括分析耗时长、不能高通量、对标本要求高等缺陷。提供了一种检测miR-150相对含量的技术，可反映个体免疫状态。miR-150茎环引物在3’端引入8个特异性核苷酸，可以逆转录成熟的miR-150，并通过茎环引物引入通用引物进行Q-PCR分析，对miR-150的差异表达进行相对定量的检测。茎环引物包含来源于水稻序列，为SEQ ID NO.1，其3’端含有8个针对miR-150的特异性核苷酸序列；及用于对miR-150进行相对定量的一对引物，miR-150特异性引物SEQ ID NO.2，5’端有带尾的结构，其3’端针对miR-150的18个特异性序列；用于Q-PCR的对侧引物由茎环引物内包含一个高质量的引物位置为SEQ ID NO.3。