[发明专利]人类免疫缺陷病毒膜分子gp120功能域与人TGF-β1的重组分子

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因重组及表达的促Treg化蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

近年来免疫耐受研究中，CD4+CD25+调控T细胞(Treg)倍受关注。Treg细胞是一种免疫调节细胞，和其他调节细胞一起，在反馈性调节中居核心地位。不少学者研究发现Treg在遏抑自身免疫病、过敏症和诱导移植耐受中发挥重要作用。但并非CD4+CD25+T细胞均为调节性T细胞，Foxp3(forkhead box P3)转录因子阳性者有此功能。Treg细胞在T细胞中所占比例很低，胸腺中占5％左右，外周占5-10％。可喜的是，目前研究发现CD4+CD25-T细胞可在一定条件下诱导转化成Treg细胞。利用转基因技术转入Foxp3基因证明，改变CD4+CD25-naive T细胞Foxp3基因的转录水平，可转化为Treg细胞，并具有天然Treg细胞的功能。还有学者用细胞因子作用于CD4+CD25-naive T细胞，也发生了转化，转化细胞同样具有相应功能。天然Treg细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能，故在先天和后天免疫系统的协同调节中起特殊作用，可抑制性调节CD4+T细胞或CD8+T细胞活化与增殖；抑制初始T细胞和记忆性T细胞的增殖。而现有免疫抑制剂的研制主要集中在如何抑制T细胞的活化与增殖。T细胞在移植排斥中起主导作用，干预T细胞的活化与增殖，可有效控制移植排斥反应。虽然降低了aGVHD的发生率，致移植物和患者的长期与近期存活率都有所提高，但仍存在不容忽视的缺点：(1)长期甚至终生服药；(2)药物作用的低或无特异性。这些药物对静息和活化免疫细胞的作用没有选择性，长期使用势必导致受者机体免疫力降低，无法抵抗移植后感染，也容易导致恶性肿瘤的发生；(3)药物具有明显的毒副作用。长期使用，出现药物的毒性作用，加速移植物失功，影响受者生存质量，移植物长期存活率的显著提高比较困难。因此，利用Treg细胞预防和治疗移植排斥和GVHD是一种更有效、更安全的新型免疫治疗策略。实现这一策略的可能途径之一是构建特异性识别CD4+T细胞同时启动Foxp3的重组分子。

人工构建由不同蛋白质结构域组成的蛋白质机器(Engineered Multi-domain ProteinMachine)是二十一世纪分子生物学领域最激动人心的前沿工作之一。根据抗原与抗体，细胞因子、生长因子和激素与受体等相互识别原理，将对细胞有杀伤作用的分子与抗体或相关因子连接，构建的蛋白质机器具有细胞的选择性清除功能。利用蛋白质机器原理，人工构建的促CD4+CD25-naive T细胞转化为Treg细胞的重组分子由导向片段和功能片段两部分构成，其中间通过一段柔性linker连接。导向片段识别细胞表面分子，重组分子特异性的高低直接取决于被导向片段识别的分子在细胞表面的特异性程度。能够特异性的识别并结合CD4的分子主要有CD4单克隆抗体、CD4单链抗体(Single Chain fragment variable，scFv)、CD4双价单链抗体(disulfide stabilize Fvs，dsFv)、人类免疫缺陷病毒(HIV)的被膜蛋白gp120。单克隆抗体能特异性识别肿瘤相关抗原及细胞表面特异性抗原，因而是应用最广的免疫毒素导向片段，但是完整的抗体(主要是非人源抗体)分子量大，穿透力弱，免疫原性强，又限制了临床应用。理论上单链抗体(Single Chain fragment variable，scFv)和双价单链抗体(disulfide stabilize Fvs，dsFv)，这类抗体分子量小，穿透力强，避免了Fc段引起的非特异性细胞毒性及免疫原性，是目前认为最理想的导向片段。但是由于膜分子CD4存在很大变异，制备工艺复杂。而gp120分子也能特异性的识别并结合CD4分子。有研究发现gp120不仅可以特异性识别并结合CD4分子，而且可在体外及体内活化Treg细胞。gp120刺激Treg细胞后可使cAMP在胞浆内聚集。而抑制内源性cAMP合成可阻止gp120活化Treg细胞。gp120的耐受效应依赖于Treg细胞的存在及通过gp120介导的活化使cAMP的上调。在异种移植引起的GVHD模型中，单次剂量的gp120即可抑制致死性GVHD，实验还发现通过刺激CD4受体使T细胞受体依赖的Treg活化通路激活从而诱导体内免疫耐受。但gp120分子较大，存在免疫原性高等缺点。gp120由恒定区和高变区组成：V1～V5区段为高变区，位于gp120表面，C1～C5区为稳定区，主要位于gp120核心区域。gp120的第4恒定区(C4)是gp120与CD4结合的主要区域，V3区对HIV侵入有重要的辅助作用，此外，gp120的第2恒定区(C2)，第3恒定区(C3)，第4高变区(V4)也有一定的辅助作用。因此选择HIV gp120分子的C2-C4区作为靶向片段，不仅保留了gp120与CD4结合的功能以及在Treg细胞活化中的作用，而且小片段相对容易制备，免疫原性较低。