[发明专利]一种来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属微生物领域，涉及一种来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO及其制备方法和应用，具体涉及一种利用功能互补法从来自被芳香族化合物污染的土壤中能以色氨酸为底物合成靛蓝的恶臭假单胞菌克隆、编码黄素单加氧酶(FMO)基因，并将该基因重组到大肠杆菌体内，得到的一种具有黄素单加氧酶活性的重组菌，将其命名为黄素单加氧酶基因FMO。在有色氨酸存在的条件下，用该黄素单加氧酶基因FMO可合成靛蓝。

背景技术

靛蓝是最早发现的天然染料之一，广泛应用于印染、医药和食品等工业。大部分靛蓝是由化学法生产，天然靛蓝比例非常小。从自然作物中提取远远不能满足生产需求，研究者将眼光转向能够生产色素的微生物。微生物生长快、培养容易，易于工业化，利用微生物生产天然色素的技术具有广阔的发展前景。

微生物合成靛蓝最早的报道是在1982年，研究者从土壤中分离到一株氧化吲哚假单胞菌(Pseudomonans indoloxidaes)通过氧化吲哚合成靛蓝【任吉元，王文涛等，染料工业，1997】。到20世纪80年代中期，研究者开始对生物合成靛蓝的原理进行深入研究，结果发现真菌合成靛蓝的周期太长，1个周期至少要1个月，而细菌的周期相对较短，1个周期一般为18-24h，产量较高，于是研究者重点对细菌进行相关研究。

20世纪80年代中期，研究者发现细菌合成靛蓝的两条路径。即微生物合成靛蓝的双加氧酶途径和羟化酶途径。1983年美国Texas大学微生物系和应用微生物学中心的Ensley等利用遗传工程技术，选育出能够产生靛蓝的菌株。这种菌株的选育，主要是把2种酶编码的基因组建在一个菌株中，首先由色氨酸酶将色氨酸转变成吲哚，然后由萘双加氧酶将吲哚氧化成吲羟【Ensley B.D.Science.1983，222(4620)：167-169】。1985年瑞士日内瓦大学的Mermod等报道了另一种合成靛蓝的途径。即一种假单胞菌(Pseudomonae putida mt-2)中含有可以降解甲苯、二甲苯或甲苯的其他衍生物的酶的基因。这种基因在TOL质粒上，利用二甲苯氧化酶的释放、产生、脱羟和单加氧化作用。以吲哚作为靛蓝的前体，在二甲苯氧化酶的作用下，直接在C3位置发生羟化生成吲羟，单加氧酶使双键发生环化再经空气氧化，自动二聚形成靛蓝【Mermod N.Bio Technology.1986，4(4)：321-324】。

长期以来研究者沿着这两条路径来寻找新的突破。并最终确定了苯乙烯单加氧酶、苯酚羟化酶、黄素单加氧酶等。在20世纪末，研究者发现细胞色素P450酶在生物合成靛蓝中的也具有重要作用【李红梅等，生物化学与生物物理进展。2005，32(7)：1-6】。

对生物合成靛蓝的酶的研究目前仍主要集中在双加氧酶和单加氧酶上，细胞色素酶的研究也是最近才开始，而其反应系统要比双加氧酶和单加氧酶复杂很多，并且由于反应机理的限制，要想取得重大突破还是需要付出更多努力来寻找创新点。开发新菌种仍然是未来的努力方向【辛嘉英等，现代化工，2008，28(7)：31-35】。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO及其制备方法和应用，所述基因来源于受萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤中筛选获得的能在色氨酸存在时合成靛蓝的恶臭假单胞菌。

本发明的技术方案是通过以下方式来实现的。

所述的来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO，编码成一个新型的黄素单加氧酶，其核苷酸序列如SEQ ID No1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。

所述的黄素单加氧酶基因FMO的获取方法如下：利用含0.001％色氨酸的LB培养基，从被萘、苯酚等芳香族化合物污染的土壤微生物中，选择菌落颜色为靛蓝色的菌株；再将选择出来的菌落置于LB液体培养基中培养12小时以上；之后提取总DNA，用0.02-0.5u/μL浓度限制性核酸内切酶Sau3A酶切提取所得的总DNA，时间20-60分钟，并将酶切片段连接到表达载体pG251(CN1338515NCBI)中，将连接物转化到感受态大肠杆菌菌株DH5α中，提取质粒pFMO，再次转入大肠杆菌DH5α，涂布于含有0.001％色氨酸的LB平板上，挑选颜色为靛蓝色的菌落。从该靛蓝色菌种克隆抽提的质粒pFMO再次转入大肠杆菌DH5α，结果证明这个克隆所产生的菌落均为靛蓝色，对质粒pFMO进行测序，即得本发明的黄素单加氧酶基因FMO。

所述的来自恶臭假单胞菌的黄素单加氧酶基因FMO的具体获取方法，包括以下步骤：

1、菌种分离