[发明专利]一种糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法，尤其涉及一种糖蔗通过组织培养方式进行茎尖脱毒快繁的方法，属于植物脱毒培养快繁技术领域。

背景技术

甘蔗宿根矮化病（Ratoon stuning disease，RSD）于1944～1945年首次在澳大利亚昆士兰州甘蔗品种Q28上发现，如今在中国主产蔗区及世界各地蔗区广泛发生，导致种性衰退，严重影响品质，很大程度上缩短了优良品种的经济使用年限。

甘蔗宿根矮化病是由（Clavibacter xyli subsp.Xyli，Lxx）引起的，RSD蔗株平均感染率50%左右，通常造成甘蔗减产12~37%，在干旱情况下减产高达60%，蔗糖分降低0.5%（绝对值），是甘蔗重要的病害之一，其病原为棒状杆菌属细菌，寄生于蔗株的维管束中，受害的甘蔗发育阻滞，宿根发株少，生长不良，叶缘枯死，严重影响甘蔗产量和品质。防止或者控制该病害的发生对甘蔗产业的稳健发展十分重要，甘蔗健康种苗在甘蔗生产上的应用显得尤为重要。

RSD主要通过收获机械和带病蔗种传播，对于RSD的传播的控制，目前国内外有一些行之有效的方法，其中广泛使用的方法是温汤处理，即下种前用50℃热水浸种2h，该方法简单有效，但是有些品种的腋芽对温度敏感，温汤处理后引起出苗率下降，且人力物力消耗较大，所以采用无病毒健康的植株成为人们研究的一个方向。

 迄今为止，获得无病毒植株的方法有多种，例如热处理脱毒、愈伤组织培养脱毒、茎尖微嫁接脱毒以及组合方法。利用甘蔗顶芽和腋芽的茎尖愈伤组织途径获得脱毒苗的专利仅见报道CN101138321A；而其中普遍采用的较好方法为微茎尖培养脱毒法，其中具体步骤是：采取植物顶端分生组织，于显微镜下切取微茎尖（0.2mm以下分生组织），诱导其萌发，分化成小植株获得脱毒苗。该方面已经有CN1031637A、CN1238122A、CN1258435A、CN1258436A等专利公开了相关技术方法，均披露了采用微茎尖作为外植体，通过微小的茎尖培养途径得到脱毒苗的方法。但是上述途径存在的问题是：①愈伤组织途径：虽然短期内通过愈伤组织可获得大量的组培苗，但其存在易变异的弱点；②微茎尖途径：首先要切取大小为0.2mm以下的茎尖分生组织，此项需在显微镜下操作，具有一定难度，并且这种微小的茎尖分生组织成活率非常低，一定程度上存在着人力物力的浪费。

综上所述，鉴于甘蔗脱毒苗是目前国际上防治宿根矮化病最为有效的途径，因此，生产上迫切需要一种更好的方法来解决糖蔗种苗组培脱毒快繁的技术应用问题。

发明内容

本发明目的是针对上述微茎尖分生组织脱毒法存在的操作难度大、成活率低等缺陷，提出一种经过消毒的预处理后，以切取较大的糖蔗顶芽和腋芽的茎尖为外植体，先诱导其萌发，再分化形成完整植株的方法，以便能够在短期内，更为有效的获得大量的脱毒苗。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种糖蔗茎尖组培脱毒快繁的方法，按如下步骤进行：

1.培养基的配制，包括培养基的基本成分与不同培养阶段的培养基各组分及其含量为：

基本培养基：MS培养基和蔗糖25~35g/L， PH值为5.8~6.2；

茎尖诱导培养基：MS培养基、吲哚丁酸IBA0.01~0.03mg/L和活性炭0.8~1.2g/L；

分化培养基：MS培养基、6-苄氨基嘌呤6-BA0.1~0.8mg/L和吲哚丁酸IBA0.01~0.03mg/L；

壮苗培养基：MS、蛋白胨0.1~0.3 g/L 和酵母0.1~0.3 g/L；

生根培养基：MS培养基、吲哚丁酸IBA0.1~0.3mg/L、萘乙酸NAA0.1~0.3mg/L和蔗糖40~60g/L；

2.外植体预处理：将糖蔗的顶芽和按照双芽截成的茎段→用75%酒精和新洁尔灭预处理→经50~55℃热水处理25~35分钟后→置于人工气候箱内高温催芽（35~40℃，培养1周），或置于温室细河沙培养1周后，作为所用的外植体；

3.茎尖诱导：将上述经过预处理后的顶芽和萌发的腋芽在无菌条件下摘取1~2mm的茎尖组织，接种在茎尖诱导培养基上，诱导其萌发芽点。

4.分化培养：将步骤3萌发的芽接种在分化培养基上，分化出大量的丛芽；

5.壮苗培养：将步骤4分化出的丛芽置于壮苗培养基上，培养一个周期，获得健壮的丛芽；

6.生根培养：将步骤5经过壮苗的丛芽接种在生根培养基中进行生根培养；

7.移栽：当步骤6的生根苗长至3~5cm，根数5条以上时，进行假植，移栽于室外培养至成苗。